N-乙酰半胱氨酸對人臍靜脈內皮細胞eNOS的保護作用

王凌霄　王阿磊　丁　菁　張　倩　黃　華　姜君財　陸德琴

(貴州醫科大學病理生理學教研室，貴州　貴陽　550025)

內皮功能障礙(ED)是心血管疾病發生發展的共同始動因素，氧化應激損傷是導致ED的主要原因之一〔1〕。生理情況下血管內皮細胞分泌的一氧化氮(NO)在維持血管穩態中起著重要的作用，NO在一氧化氮合酶(NOS)的催化下產生，主要來源于內皮型NOS(eNOS)。ED的重要表現之一是eNOS/NO功能受損，其機制可能與eNOS活性下降及NO生物利用度降低有關。蛋白磷酸酶(PP)2A是目前已知還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(Nox)源性活性氧(ROS)的主要靶蛋白之一，也是使eNOS Ser1177/1179去磷酸化的主要磷酸酶〔2〕。研究發現N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為一種ROS清除劑可以減輕氧化應激，對血管形態及功能起到保護作用〔3〕。血管緊張素(Ang)Ⅱ可通過多種途徑產生大量的ROS，從而造成ED〔4〕。本研究對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)給予AngⅡ刺激，同時使用NAC對HUVECs進行預處理，初步探討NAC預處理對內皮細胞eNOS活性的保護作用及機制。

1　材料和方法

1.1實驗試劑及儀器HUVECs由貴州醫科大學曾柱教授惠贈；胎牛血清(FBS)、無酚紅高糖DMEM培養基(Gibco)；高糖DMEM培養基、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶(HyClone)；NAC、AngⅡ(Sigma)；聚氟偏乙烯(PVDF)蛋白雜交膜(Millipore)；電化學發光法(ECL)增強化學發光試劑盒(Bio-Rad)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo)；鼠抗人eNOS抗體(BD)；兔抗鼠eNOS Ser1177抗體(Millipore)；兔抗鼠PP2A-c Y307抗體(Abcam)；兔抗鼠PP2A-Cα抗體、羊抗兔I2PP2A抗體、兔抗鼠β-tubulin抗體、辣根過氧化酶標記的羊抗兔Ⅱ抗、羊抗鼠Ⅱ抗、兔抗羊Ⅱ抗(Santa Cruz)；兔抗人Ⅷ因子相關抗原抗體、兔抗人CD34抗體(北京博奧森生物公司)；鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)法檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；BX41顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS)；ROS檢測試劑盒(碧云天)；NOS分型測定及NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2HUVECs細胞培養HUVECs接種于無菌25 cm2培養瓶中，于37℃、5 %CO2的培養箱中用含10% FBS高糖DMEM培養基培養，每48 h更換一次培養液，當細胞生長達到80%左右時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代。實驗取4～10代的細胞。

1.3細胞鑒定細胞爬片后，于六孔板中培養。待密度至50%左右時，用無FBS培養基靜止12 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，采用4%多聚甲醛固定，用兔抗人Ⅷ因子相關抗原抗體和兔抗人CD34抗體作為Ⅰ抗，1∶100稀釋后，SABC法進行免疫細胞化學染色。PBS培養作為陰性對照。鏡下胞質內出現棕黃色顆粒者為陽性細胞。200倍顯微鏡下隨機取5個視野計數陽性細胞，陽性細胞率(%)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.4分組

1.4.1單純AngⅡ處理實驗HUVECs隨機分為正常對照組和AngⅡ組(AngⅡ濃度分別為1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L，處理12 h)。通過Western印跡檢測eNOS Ser1177磷酸化水平，AngⅡ最終使用濃度取1×10-7mol/L和1×10-6mol/L，處理時間12 h進行實驗。

1.4.2NAC預處理實驗根據參考文獻〔5〕，采用終濃度為1×10-3mol/L的NAC預處理1 h，隨機分為正常對照組、AngⅡ(1×10-7mol/L和1×10-6mol/L，處理12 h)組、單純NAC組、NAC(預處理)+AngⅡ(1×10-7mol/L、1×10-6mol/L)組。

1.5細胞內ROS的測定于六孔板中培養HUVECs，隨機分為正常對照組和AngⅡ組，作用12 h后去除細胞培養液，加入1.5 ml終濃度為10 μmol/L的熒光探針二氯熒光磺雙乙酸鹽(DCFH-DA，使用無FBS培養基稀釋)，于37℃、5%CO2的培養箱內孵育20 min，用無FBS培養基洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。使用488 nm激發波長、525 nm發射波長于倒置熒光顯微鏡觀察熒光并拍照，采用Image J軟件分析DCF的熒光強度。

1.6Western印跡檢測蛋白水平分別收集各組細胞，加入蛋白裂解液，冰上刮取細胞后裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心取上清，BCA法測定蛋白濃度，其余蛋白變性后十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，上樣，轉膜，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后孵育Ⅰ抗4℃過夜。次日TBST洗膜后，加入Ⅱ抗，常溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影曝光。用Bio-Rad凝膠成像系統軟件分析蛋白條帶相對積分吸光度值。

1.7化學比色法檢測HUVECs中細胞組成型一氧化氮合酶(cNOS)活性細胞處理完畢后使用0.25%胰蛋白酶消化，采用含10% FBS的高糖DMEM培養基終止消化，重懸，1 000 r/min離心5 min，得細胞沉淀。加入適量PBS洗滌細胞，1 000 r/min離心6 min，棄上清，重復洗滌2次。在細胞沉淀中加入300 μl的PBS，混勻，超聲粉碎細胞，取上清進行蛋白濃度測定和cNOS檢測。所有檢測均復6孔。

1.8化學比色法檢測HUVECs培養基中NO含量細胞處理完畢后分別對應收集各組培養基，按試劑盒說明書添加試劑一和二，混勻后于酶標儀550 nm波長處測各組A值。所有檢測均復6孔。

1.9統計學方法應用SPSS17.0軟件，計量資料樣本均數比較前先進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多組間兩兩比較采用SNK-q法。

2　結　果

2.1細胞鑒定結果免疫組織化學染色結果顯示，在培養的HUVECs中，Ⅷ因子相關抗原和CD34表達陽性，陰性對照組未見胞質黃染，計算陽性細胞率為100%。見圖1。

A：Ⅷ因子相關抗原陰性對照；B：HUVECs中Ⅷ因子相關抗原陽性表達；C：CD34陰性對照；D：HUVECs中CD34陽性表達圖1　Ⅷ因子相關抗原和CD34在HUVECs中的表達(SABC,×200)

2.2AngⅡ刺激HUVECs后下調eNOS Ser1177磷酸化水平各劑量AngⅡ刺激HUVECs 12 h后，與正常對照組比較及各組間eNOS蛋白表達比較差異均無統計學意義(P>0.05)，各劑量AngⅡ組eNOS Ser1177磷酸化水平均明顯低于正常對照組(P<0.05)，AngⅡ各組間eNOS Ser1177磷酸化水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

1:正常對照組；2:AngⅡ10-9mol/L組；3:AngⅡ10-8mol/L組；4:AngⅡ10-7mol/L組；5:AngⅡ10-6mol/L組；6:AngⅡ10-5mol/L組;與正常對照組相比:1)P<0.05圖2　AngⅡ刺激HUVECs 12 h后各組eNOS蛋白表達及eNOS Ser1177磷酸化水平的變化

2.3AngⅡ刺激HUVECs后增加ROS的產生AngⅡ(1×10-7mol/L、1×10-6mol/L)刺激HUVECs 12 h后，DCF熒光強度與正常對照組比較明顯增加(P<0.05)。見圖3。

與正常對照組比較：1)P<0.05圖3　AngⅡ刺激HUVECs 12 h后細胞中DCF的熒光強度(×200)

2.4NAC預處理增加eNOS Ser1177磷酸化水平各組間eNOS蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，AngⅡ10-7mol/L組、AngⅡ10-6mol/L組與正常對照組比較eNOS Ser1177磷酸化水平明顯降低(P<0.05)；與同濃度AngⅡ組比較，NAC預處理后eNOS蛋白表達差異仍無統計學意義(P>0.05)，eNOS Ser1177磷酸化水平明顯增加(P<0.05)。AngⅡ各濃度組間、NAC預處理+AngⅡ各濃度組間比較，上述指標變化差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

1:正常對照組；2：AngⅡ10-7mol/L組；3:AngⅡ10-6mol/L組；4:NAC組；5：NAC+AngⅡ10-7mol/L組；6：NAC+AngⅡ10-6mol/L；與正常對照組比較，1)P<0.05；與AngⅡ10-7mol/L組組比較，2)P<0.05；與AngⅡ10-6mol/L組比較，3)P<0.05；下圖、下表同圖4　NAC預處理對AngⅡ刺激HUVECs后各組eNOS蛋白表達及eNOS Ser1177磷酸化水平的影響

2.5NAC預處理增加PP2A-c Y307磷酸化水平和I2PP2A蛋白表達水平AngⅡ刺激后PP2A-Cα蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，PP2A-c Y307磷酸化水平、I2PP2A蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與同濃度AngⅡ組比較，NAC預處理后PP2A-Cα蛋白表達差異仍無統計學意義(P>0.05)，PP2A-c Y307磷酸化水平、I2PP2A蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)。各濃度AngⅡ組間、NAC+AngⅡ各濃度組間比較上述指標變化均無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5　NAC預處理對AngⅡ刺激HUVECs后各組PP2A-Cα、I2PP2A蛋白表達和PP2A-c Y307磷酸化水平的影響

2.6NAC預處理增加細胞cNOS活性及培養基中NO的含量AngⅡ刺激后，cNOS活性、培養基中NO含量均明顯降低(P<0.05)；與同濃度AngⅡ組比較，NAC預處理后cNOS活性、培養基中NO含量均明顯增加(P<0.05)。AngⅡ各濃度組間、NAC+AngⅡ各濃度組間比較，cNOS活性、NO含量差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組cNOS活性和培養基中NO含量的變化

3　討　論

氧化應激發生時，ROS產生增多，可導致內皮細胞損傷。因此，減少氧化應激，改善內皮細胞功能，已經成為防治心血管疾病的研究熱點。

eNOS活性調控的機制之一是其多個絲/蘇氨酸位點的磷酸化，其中eNOS Ser1177/1179磷酸化上調可使eNOS活性增強，NO產生增多〔6〕。cNOS包括神經元型NOS(nNOS)和eNOS，因此cNOS活性本應是兩者活性之和。但研究發現，血管內皮細胞主要以eNOS表達為主〔7〕，且本課題組前期使用免疫組化的方法證實nNOS在血管內皮細胞中表達很低〔8〕，故本研究中測定的cNOS活性可以代表eNOS活性。

AngⅡ刺激后可產生大量ROS，通過抑制蛋白激酶B(Akt)/eNOS信號途徑，從而下調eNOS 1177磷酸化水平，造成血管內皮功能障礙〔9〕。本研究結果提示AngⅡ刺激可產生大量的ROS，eNOS Ser1177磷酸化水平下調，從而發生內皮功能紊亂。研究表明Akt可以上調eNOS Ser1177/1179磷酸化水平〔10〕；且有報道PP2A是Nox源性ROS的靶蛋白之一，而PP2A可使Akt、eNOS Ser1177〔2〕發生去磷酸化。PP2A是一種絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可使蛋白質脫磷酸，在PI3K/Akt/eNOS信號通路中起負性調控作用〔11〕。PP2Ac高度保守C端尾巴可發生翻譯后磷酸化和甲基化修飾，磷酸化可發生在Tyr307上，抑制PP2A酶活性〔12〕。PP2A包括I1PP2A和I2PP2A兩種胞內具有特異性、非競爭性和熱穩定性的抑制蛋白〔13〕。Li等〔14〕從牛腎抽提物中純化出I2PP2A蛋白，能顯著抑制PP2A的活性。因此本研究主要檢測PP2A-c Y307磷酸化水平和I2PP2A蛋白表達水平，作為對PP2A活性的判斷。結果顯示，AngⅡ刺激產生了大量的ROS，可能通過下調PP2A-c Y307和I2PP2A水平激活PP2A，PP2A可間接通過Akt去磷酸化或直接作用從而下調eNOS Ser1177磷酸化水平，降低eNOS活性及培養基中NO含量，最終導致內皮細胞功能受損。

NAC是含巰基的谷胱甘肽(GSH)的前體，作為一種ROS清除劑，具有清除氧自由基的作用，可以改善內皮細胞功能障礙。研究發現，在HUVECs中使用NAC可清除ROS，通過激活Akt/eNOS信號通路，從而上調eNOS 1177磷酸化水平〔15〕。本研究結果顯示，NAC預處理可能通過清除ROS，激活Akt/eNOS信號通路，從而發揮保護eNOS活性的作用。有研究報道，在人類前列腺細胞株DU145中使用NAC清除ROS后，可抑制PP2A活性，進而激活PI3K/Akt信號通路〔16〕。在研究成纖維細胞自噬過程中，使用NAC清除ROS后可通過抑制半胱氨酸殘基的亞磺酰化作用，從而降低PP2A活性，且此過程中檢測到PP2A-c Y307磷酸化水平增加〔17〕。本研究結果顯示，NAC預處理可能通過減少ROS生成，上調PP2A-c Y307和I2PP2A使PP2A活性降低，從而上調eNOS Ser1177磷酸化水平，增加eNOS活性，進而發揮保護內皮細胞的作用。

綜上，AngⅡ可能通過降低PP2A-c Y307和I2PP2A使PP2A活性增加，最終導致eNOS活性降低；NAC預處理可通過增加PP2A-c Y307和I2PP2A，從而降低PP2A活性，發揮保護內皮細胞eNOS活性的作用。

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