不同灸量麥粒灸對神經根型頸椎病模型大鼠JAK1、STAT3的影響

粟勝勇　李妮娜　覃忠亮　趙　駿　陳　霞　邱　菊　黃云龍

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西　南寧　530023)

艾灸可使類風濕關節炎(RA)家兔滑膜組織的信號傳導及轉錄激活因子(STAT)3基因表達下降，并通過調控STAT5基因表達，良性調控Janus激酶(JAK)-STAT信號通路。同時，文獻報道 STAT3 基因表達下降，可有效緩解關節炎癥狀〔1〕。麥粒灸是灸法中的一種，治療神經根型頸椎病(CSR)具有確切的療效，且目前臨床治療量多選擇5壯〔2～4〕，缺乏麥粒灸治療本病量效關系的相關研究。本研究擬評價JAK-STAT 信號轉導通路途徑對麥粒灸干預CSR的量效關系。

1　材料與方法

1.1動物及分組由廣西醫科大學動物實驗中心提供的，生產批號為：SCXK桂2014-0002，SPF級Wistar大鼠60只，體重(250±20)g，隨機分為正常組、模型組、麥粒灸3壯組、麥粒灸6壯組、麥粒灸9壯組各12只，雌雄各半。動物在實驗前適應性馴養1 w。

1.2主要試劑和儀器試劑：蘇木素(北京中杉金橋)，鹽酸、二甲苯、無水乙醇(天津永大)，磷酸鹽緩沖液(PBS，河北博海生物)，氨水(北京中杉金橋)，切片石蠟(北化康泰)，抗原修復液(河北博海生物)，中性樹膠(河北博海生物)等。儀器：蓋玻片(重慶化玻廠)，超凈工作臺(蘇州，BCM-1000)，洗板機(美國BIO-TEK，型號ELx50)，微量震蕩器(無錫縣金城儀器廠，型號WZS-Ⅲ型)，顯微鏡(日本，BX51T-PHD-J11)，倒置照相顯微鏡(日本，Olympus CK2)，互補金屬氧化物半導體(CMOS)(日本奧林巴斯)，多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus)等。

1.3造模方法參照竇夏睿等〔5〕法進行，大鼠麻醉用10%水合氯醛溶液，按0.35 ml/100 g劑量腹腔注射，待麻醉后俯臥位固定，以手觸下頸部附近最高棘突(T2)中心點，將大鼠頸部及上背部毛采用剃須刀剃凈，常規消毒后，由此向上于背部正中線做3 cm左右切口，逐層鈍性分離皮下組織、頸后部肌群(盡量減少對肌肉組織的大面積破壞)，直至C6～T2左側椎弓充分暴露，刮凈其表面肌肉和韌帶等組織，用顯微鑷輕輕挑開C7和T1，C6和C7椎間隙的黃韌帶和結締組織，用尖嘴蚊式鉗輕輕鉗開C7左側椎弓，暴露脊髓，用眼科神經剝離子將脊髓輕推至右側，再用顯微外科鑷將大約1.5 cm長，直徑0.5 mm的尼龍漁線輕輕沿脊髓縱軸放至C6、C7、T1神經根腋下(漁線經過酒精浸泡，無菌干燥后再浸泡至0.1%的多聚賴氨酸溶液中，以增加其組織黏附性)，插線時注意漁線不要過度下壓，以免碰破椎靜脈叢導致椎管內大量出血，最后逐層關閉傷口，縫合。模型鼠建立后，大鼠表現動作不活躍。如有外在的驚動時，只能用右上肢及雙下肢緩慢爬行，左上肢緊貼胸前，不敢觸地，肘關節、腕關節不活動，第2、3趾緊縮。同時，用棉簽輕觸C7神經根分布區，模型表現為身體迅速躲閃，并持續不斷地嘶叫。

1.4麥粒灸治療麥粒灸3壯組、6壯組、9壯組選用南陽綠瑩艾草生物制品有限公司出廠的陳年艾絨，將艾絨搓成直徑約0.5 cm，高約0.5 cm的圓錐形艾炷，參照大鼠穴位圖譜〔6〕選取大椎穴，并將穴位皮膚毛發用刀片刮凈，涂少許萬花油，將艾炷置于大鼠穴位皮膚上點燃，灸至大鼠發出連續尖叫聲，并出現掙扎等逃避行為時用鑷子將艾炷取下，為1壯，1次/d，連續干預7 d。

1.5標本取樣與處理動物于造模艾灸干預 7 d后，分別處死大鼠，取出壓線段脊柱，掀開背側椎板(避免壓傷脊髓)，選用小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，經過4%多聚甲醛進行固定后剝去脊髓及神經根周圍骨質及肌肉成分石蠟包埋，在脊髓發出神經根的部位做5 μm厚連續切片，均采用免疫組織化學SABC染色法分別進行免疫球蛋白(Ig)G染色，進行JAK1、STAT3免疫組化測定。

1.6指標檢測方法采用免疫組化方法測定：取脊髓神及經根組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，蠟塊組織切片厚度約5 μm，防脫切片經過常規脫蠟、脫水；修復抗原，滴加封閉液；根據組化試劑盒步驟進行操作，光鏡下觀察及多功能真彩色細胞圖像分析管理系統觀察等。用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照，采用半定量計分方法計算最終顯色指數。

1.7統計學方法應用SPSS17.0軟件進行t檢驗、q檢驗。

2　結　果

模型組JAK1、STAT3表達均顯著高于正常組(均P<0.001)。不同灸量麥粒灸組JAK1、STAT3表達均顯著低于模型組(P<0.05)；麥粒灸6壯組JAK1、STAT3表達均顯著低于麥粒灸3壯組、9壯組(P<0.01)；麥粒灸3壯組與9壯組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組壓線處脊髓及神經根組織JAK1、STAT3表達比較個/視野)

與模型組比較：1)P<0.05；與麥粒灸6壯組比較：2)P<0.01；與正常組比較：3)P<0.001

3　討　論

JAK-STAT轉導通路系統是眾多細胞因子信號轉導的共同途徑，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡及炎癥等過程〔7〕，與CSR疼痛機制密切相關的多種炎性細胞因子，如前列腺素(PG)E2、環氧化酶(COX)-2、白細胞介素(IL)-6、IL-8等的表達均都受到JAK-STAT信號通路的調控。柴立民等〔8〕在膠原誘導性關節炎(CIA)模型大鼠中發現，益氣活血解毒方能夠抑制IL-6介導的JAK/STAT細胞信號通路活性，從而抑制關節軟骨及骨質的炎性損傷。Hui等〔9〕在研究兩棲動物脊髓損傷和再生中發現STAT3在急性脊髓損傷后表達增高。Dominguez 等〔10〕研究表明在外周神經損傷后脊髓小膠質細胞中JAK-STAT3通路激活，其激活可能與外周神經損傷后的疼痛相關。以上研究提示JAK-STAT 信號轉導通路可能是相關因子信號轉導的重要通路。實驗發現〔11，12〕艾灸可顯著降低實驗性RA家兔滑膜液炎癥相關細胞因子的含量，降低實驗性RA家兔滑膜組織JAK1、JAK2，STAT1、STAT4的基因表達，認為艾灸對動物模型滑膜細胞JAK-STAT 信號通路中相關信號分子表達的有效調控可能是其實現抗炎效應的重要分子機制之一。目前針對不同灸量麥粒灸的研究發現〔13〕，采用艾條、大艾炷、小艾炷治療3種不同的灸量灸法進行調治原發性痛經，結果證實，3種治療方法均能有效緩解疼痛，提高療效；其中艾炷可顯著提高患者的皮溫耐受性，降低患者穴位皮阻，提高患者對疼痛的耐受性。研究表明〔14〕不同灸量麥粒灸對急性高血脂狀態大鼠均具有普遍性調節效應，其中降低甘油三酯方面 6壯和 9壯的效應最佳，升高高密度脂蛋白膽固醇方面 3壯和藥物的效應更優。大椎穴為陽脈之海，是六陽經的交會穴，又為督脈之穴，是溫陽之重穴，是調節一身陽氣的樞紐，對應CSR癥狀表現部位頸部疼痛、僵硬，上肢的放射痛、麻木等，恰與督脈、足太陽、足少陽及手三陽經循行支配部位吻合，取大椎即能一穴遍通上述諸經，直達病所。本實驗研究結果表明，CSR模型大鼠脊髓及神經根組織JAK1、STAT3細胞因子表達增加；不同灸量的麥粒灸可能通過JAK-STAT信號轉導通路激活，起到調節CSR脊髓或神經根損傷后JAK1、STAT3細胞因子表達的作用。本實驗研究結果發現麥粒灸6壯組在干預CSR時療效最佳。

1De Hooge AS，van de Loo FA，Koenderes MI，etal.Local activaion of STAT1 and STAT3 in the inflamed synovium during zymosan-induced arthritis：exacerbation of jiont inflammation in STAT1 gene-knockout mice〔J〕.Arthritis Rheum，2004；50(66)：2014-23.

2狄忠，姜碩，林咸明，等.針刺配合麥粒灸治療頸椎病頸痛近期及遠期療效評價〔J〕.中國針灸，2014；34(4)：325-8.

3陳麗婷.麥粒灸和溫和灸治療神經根型頸椎病的臨床療效對比研究.〔D〕.廣州：廣州中醫藥大學，2015.

4尹建平.針刺配合麥粒灸對頸椎病頸痛患者頸部壓痛閾的影響〔J〕.臨床醫學研究與實踐，2016；1(9)：55-6.

5竇夏睿，孫建寧，王威，等.中藥復方頸舒片對大鼠神經根型頸椎病模型感覺功能的影響〔J〕.中國藥學雜志，2007；42(8)：578-81.

6華興邦，周浩良.大鼠穴位圖譜的研制〔J〕.實驗動物與動物實驗，1991；(1)：1-5.

7薛翔，劉紅梅，邵旦兵，等.JAK/STAT 信號通路調節機制的研究進展〔J〕.現代生物醫學進展，2015；15(11)：2161-5.

8柴立民，董玢，婁利霞，等.益氣活血解毒方對膠原誘導性關節炎大鼠Jak/Stat信號通路相關因子表達的影響〔J〕.中華中醫藥雜志(原中國醫藥學報)，2015；30(9)：3364-7.

9Hui SP，Sengupta D，Lee SG，etal.Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish〔J〕.PLoS One，2014；9(1)：e84212.

10Dominguez E，Rivat C，Pommier B，etal.JAK/STAT3 pathway is activated in spinal cord microglia after peripheral nerve injury and contributes to neuropathic pain development in rat〔J〕.J Neurochem，2008；107(1)：50-60.

11劉旭光，房翳恭，余曙光，等.艾灸對實驗性RA家兔關節滑膜液FGF、EGF、PDGF含量的影響〔J〕.中醫藥學刊，2006；24(3)：428-9.

12楊馨，李繼書，楊慎峭，等.艾灸對實驗性類風濕性關節炎家兔滑膜細胞JAK-STAT信號通路影響的研究〔J〕.針刺研究，2007；32(2)：75-82.

13劉春燕，張曉慧.不同灸量灸法對原發性痛經療效的影響〔J〕.臨床醫藥實踐，2010；19(8B)：1121-2.

14張細柳，王士超，王耀帥，等.不同灸量麥粒灸調節血脂效應的比較研究〔J〕.中醫雜志，2011；52 (5)：413-5.