參松養(yǎng)心膠囊對(duì)兔心肌梗死后心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

汪　琳　劉書芳　劉　穩(wěn)　彭　聰

(漯河市中心醫(yī)院　漯河醫(yī)專第一附屬醫(yī)院高血壓科,河南　漯河　462000)

心肌梗死是臨床上常見(jiàn)的心臟疾病，多數(shù)患者常常會(huì)伴有心律失常，嚴(yán)重者甚至?xí)霈F(xiàn)室顫而導(dǎo)致猝死。參松養(yǎng)心膠囊是由多種中藥組成的復(fù)方制劑，主要有五味子、麥冬、丹參、黃連等〔1〕。有研究發(fā)現(xiàn)，參松養(yǎng)心膠囊能夠改善心肌梗死患者的預(yù)后，降低病死率和死亡率，可以通過(guò)調(diào)控各種離子通道蛋白的表達(dá)從而保護(hù)心肌細(xì)胞〔2，3〕，而具體離子通道尚不十分明確。已有研究證實(shí)鈣離子通道在心肌梗死后的心肌細(xì)胞保護(hù)中占有重要地位〔4〕；抗心肌梗死藥物普萘洛爾可以通過(guò)恢復(fù)心肌梗死的動(dòng)作電位時(shí)程等途徑保護(hù)心肌細(xì)胞〔5〕，臨床上對(duì)心肌梗死患者常常采用參松養(yǎng)心膠囊與普萘洛爾的聯(lián)合用藥方案。本研究通過(guò)建立心臟梗死的新西蘭大耳白兔動(dòng)物模型，研究參松養(yǎng)心膠囊對(duì)鈣離子通道蛋白，如縫隙鏈接蛋白(Cx)43、鈉鈣交換體(NCX)及蘭尼堿受體蛋白(RyR)2表達(dá)水平的影響，探究參松養(yǎng)心膠囊對(duì)心肌梗死模型心肌細(xì)胞的可能作用機(jī)制，同時(shí)探究普萘洛爾是否具有增強(qiáng)參松養(yǎng)心膠囊保護(hù)心肌梗死后心肌細(xì)胞的作用。

1　材料與方法

1.1材料新西蘭大耳白兔雄性40只，體重2.5～2.8 kg，由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。參松養(yǎng)心膠囊購(gòu)自北京以嶺藥業(yè)有限公司(批號(hào)150302)，普萘洛爾購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司(批號(hào)160518)；Cx43單克隆抗體(ab11370)，NCX單克隆抗體(ab151608)，RyR2單克隆抗體(ab2868)，GAPDH(ab9485)和辣根酶標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2動(dòng)物模型的建立及分組取新西蘭大耳白兔40只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)對(duì)照組，梗死組，梗死+普萘洛爾組，梗死+參松養(yǎng)心膠囊組，梗死+聯(lián)合用藥組各8只。梗死組以戊巴比妥(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉后，經(jīng)前胸暴露心臟，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。假手術(shù)對(duì)照組采取假手術(shù)，以戊巴比妥(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉后，經(jīng)前胸暴露心臟后在冠狀動(dòng)脈下穿線，但不結(jié)扎。以心電監(jiān)護(hù)檢測(cè)顯示Ⅰ,Ⅱ,AVL導(dǎo)聯(lián)ST段抬高0.2 mV為模型建造成功的標(biāo)準(zhǔn)〔6〕。造模成功后，分別以普食(假手術(shù)對(duì)照組、梗死組)，普食+普萘洛爾粉(梗死+普萘洛爾組，普萘洛爾劑量0.5 g·kg-1·d-1)，普食+參松養(yǎng)心粉(梗死+參松養(yǎng)心膠囊組，參松養(yǎng)心膠囊原粉0.8 g·kg-1·d-1)，普食+普萘洛爾粉+參松養(yǎng)心粉(梗死+聯(lián)合用藥組，普萘洛爾劑量0.5 g·kg-1·d- 1，參松養(yǎng)心膠囊原粉0.8 g·kg-1·d-1)，喂養(yǎng)8 w后，處死動(dòng)物，取心梗周圍心室組織。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1Western印跡方法取心梗周圍心室組織，按照RIPA裂解液說(shuō)明書提取組織細(xì)胞中的總蛋白。BCA法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。取30 μg總蛋白采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白，電泳1.5 h后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Cx43單克隆抗體，稀釋比例1∶2 000)，NCX單克隆抗體(稀釋比例1∶2 000)，RyR2單克隆抗體(稀釋比例1∶2 000)，GAPDH(稀釋比例1∶3 000)，4℃過(guò)夜，PBS清洗后加入二抗(稀釋比例1∶5 000)，37℃孵育2 h，最后電化學(xué)發(fā)光顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)測(cè)蛋白條帶光密度值。本實(shí)驗(yàn)選用GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。分別以Cx43、NCX、RyR2與GAPDH蛋白的光密度值的比值作為Cx43、NCX、RyR2的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2RT-PCR方法取心肌梗死周圍心室組織，采用Trizol試劑一步法提取組織細(xì)胞中的總RNA，嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書操作，將細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后擴(kuò)增成DNA。引物序列見(jiàn)表1，均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。RT-PCR反應(yīng)條件如下： 50℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1　RT-PCR引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1RT-PCR結(jié)果分析與假手術(shù)對(duì)照組相比，梗死組Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(t=8.485,P=0.000;t=7.483,P=0.000;t=4.234,P=0.001)；梗死+普萘洛爾組Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與梗死組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與梗死組相比，梗死+參松養(yǎng)心膠囊組Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平均增加(t=3.081,P=0.028;t=3.922,P=0.005;t=8.832,P=0.000)；梗死+聯(lián)合用藥組Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比梗死+參松養(yǎng)心膠囊組均顯著增加(t=2.263,P=0.043;t=2.776,P=0.025;t=2.451,P=0.039)。見(jiàn)表2。

2.2Western印跡結(jié)果分析與假手術(shù)對(duì)照組相比，梗死組Cx43、NCX、RyR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(t=9.346,P=0.000;t=6.132,P=0.000;t=13.673,P=0.000)；梗死+普萘洛爾組Cx43、NCX、RyR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平與梗死組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與梗死組相比，梗死+參松養(yǎng)心膠囊組的Cx43、NCX、RyR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平增加(t=3.181,P=0.028;t=3.922,P=0.005;t=6.832,P=0.000)；梗死+聯(lián)合用藥組Cx43、NCX、RyR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平比梗死+參松養(yǎng)心膠囊組均顯著增加(t=2.269,P=0.043;t=2.741,P=0.025;t=2.514,P=0.037)。見(jiàn)表3，圖1。

表2　各組心梗周圍心室組織中Cx43、NCX、RyR2 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

與假手術(shù)對(duì)照組相比：1)P<0.05；與梗死組相比：2)P<0.05；與梗死+參松養(yǎng)心膠囊組相比：3)P<0.05；下表同

表3　各組心肌梗死周圍心室組織中Cx43、NCX、RyR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平

A：假手術(shù)對(duì)照組；B：梗死組；C：梗死+普萘洛爾組；D：梗死+參松養(yǎng)心膠囊組；E：梗死+聯(lián)合用藥組圖1　各組心肌梗死周圍心室組織中Cx43、NCX、RyR2蛋白表達(dá)

3　討　論

心肌梗死是冠狀動(dòng)脈堵塞導(dǎo)致的部分心肌缺血性壞死，在我國(guó)，心肌梗死的發(fā)病率迅速上升，并且發(fā)病年齡有年輕化的趨勢(shì)〔7〕。心肌梗死的發(fā)病環(huán)節(jié)主要有微血管損傷、氧自由基的產(chǎn)生及細(xì)胞內(nèi)鈣超載等。目前臨床上，有針對(duì)心肌梗死各發(fā)病環(huán)節(jié)的治療藥物，然而心肌梗死患者的預(yù)后仍不十分樂(lè)觀，急需尋求更加有效的治療心肌梗死或降低心肌梗死后心肌細(xì)胞損傷的治療藥物或治療方案。

細(xì)胞內(nèi)鈣超載是導(dǎo)致心肌梗死后發(fā)生心律失常，最終導(dǎo)致患者不良預(yù)后的重要因素之一。鈣超載能夠通過(guò)縮短動(dòng)作電位時(shí)程，誘發(fā)短暫后除極，最終導(dǎo)致缺血性心律失常的發(fā)生。Zhang等〔8〕研究證實(shí)，抑制鈣超載可以降低心肌梗死后發(fā)生心律失常的發(fā)生率。Cx43、NCX、RyR2基因編碼相應(yīng)的鈣離子通道蛋白Cx43、NCX、RyR2，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子平衡，心肌細(xì)胞內(nèi)Cx43、NCX、RyR2的表達(dá)水平能夠反映細(xì)胞的鈣超載情況。Cx43是心室肌細(xì)胞間縫隙連接(GJ)通道的重要成員，同時(shí)也是心室肌細(xì)胞間電流傳導(dǎo)的主要導(dǎo)體〔9〕。Yuan等〔10〕研究證實(shí)，Cx43是冠狀動(dòng)脈阻塞后心肌梗死范圍大小的最主要的決定因素之一。NCX參與維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡，在缺血缺氧等病理?xiàng)l件下，NCX引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡〔11〕。RyR2是心肌肌漿網(wǎng)中的鈣通道，有研究證實(shí)，心肌梗死患者的心肌細(xì)胞中RyR2表達(dá)下降，功能抑制，導(dǎo)致心肌收縮能力下降〔12〕。本研究結(jié)果表明普萘洛爾不參與心肌細(xì)胞的鈣離子通道蛋白的調(diào)節(jié)，而參松養(yǎng)心膠囊能夠通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的鈣離子通道蛋白從而保護(hù)心肌梗死的心肌細(xì)胞；采用參松養(yǎng)心膠囊與普萘洛爾聯(lián)合用藥后，普萘洛爾能夠增強(qiáng)參松養(yǎng)心膠囊保護(hù)心肌梗死后心肌細(xì)胞的作用。

綜上所述，心肌梗死后的心肌細(xì)胞中，鈣離子通道蛋白Cx43、NCX、RyR2表達(dá)下降，參松養(yǎng)心膠囊部分逆轉(zhuǎn)Cx43、NCX、RyR2表達(dá)水平，減輕鈣超載對(duì)心肌細(xì)胞的損害，保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心功能；普萘洛爾能夠增強(qiáng)參松養(yǎng)心膠囊對(duì)心肌梗死后心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，內(nèi)在的具體作用機(jī)制尚不明確，將在以后的研究中深入探討。

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