神經生長因子對大鼠視網膜缺血-再灌注損傷的修復和保護作用

劉宏偉　孟　巖　金　鳳

(佳木斯大學第一附屬醫院，黑龍江　佳木斯　154007)

視神經是由視網膜最內層神經節細胞的部分軸突匯聚形成，當視神經受到損傷后，視網膜神經節細胞的數目會發生進行性減少，從而導致視功能的下降，這種不可逆的視功能損害嚴重危害了人類的健康〔1〕。視網膜缺血-再灌注損傷(RIRI)是臨床眼科常見的一種疾病，可以損傷視網膜神經節細胞及內核層細胞，這一過程有多種因素參與〔2〕。神經生長因子(NGF)是神經營養因子家族中的一員，是感覺神經元存活的必需因子〔3〕。在發育期大鼠視網膜神經節細胞上存在NGF的特異性受體，不同的受體對NGF的親和力也不同〔4〕。NGF在神經元的生長、發育和分化方面及其再生和功能性表達等多個方面發揮關鍵作用，還能減少細胞凋亡的發生，但目前NGF對細胞保護的具體作用機制仍不清楚。本研究擬通過大鼠視網膜缺血-再灌注模型探討NGF對RIRI的保護作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物實驗用健康無眼疾的SPF級Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重200～250 g，購自哈爾濱醫科大學實驗動物學部〔SCXK(黑)2013-001〕；實驗前在佳木斯大學實驗動物中心進行適應性飼養。正常飼養，正常光照。

1.2實驗試劑水合氯醛購自天根生化科技有限公司；NGF、酒精、甲醛溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自北京賽馳生物科技有限公司；SABC免疫組化試劑盒、c-fos和c-jun多克隆抗體均購自武漢博士德生物技術有限公司；其他實驗所用試劑均為分析純。

1.3實驗方法

1.3.1實驗動物分組及給藥將40只SPF級健康成年Wistar大鼠隨機分為4組，分別為正常組、模型組、NGF 500 BU組和NGF 1 000 BU組，每組10只，雌雄各半。腹腔內注射戊巴比妥鈉0.04 g/kg(20 g/L)麻醉，眼內滴入2滴1%鹽酸丁卡因角膜表面麻醉，治療組大鼠的右眼分別注射NGF 500 BU/眼和1 000 BU/眼；正常組和模型組大鼠左右眼、治療組大鼠左眼注射同體積生理鹽水；每天1次，連續4 d，第2 ～4次給藥前用乙醚輕麻。于首次給藥30 min后模型組和治療組大鼠進行視網膜缺血-再灌注造模。

1.3.2視網膜缺血-再灌注模型制備參照已有試驗方法〔5〕，選用一次性4號針頭自角膜緣刺入大鼠右眼前房，避開血管叢，針頭連接生理鹽水進行灌注，升高眼壓至16 kPa，灌流60 min后抽出針頭，輕壓角膜緣放出房水，眼壓恢復正常，出現血流再灌注；同時隨著眼壓下降，眼球變軟，視網膜充血，瞳孔出現紅光反射；滴加抗生素眼藥后放回飼養籠。術后第2天觀察大鼠的反應，無術眼感染，角膜渾濁，晶狀體混濁，瞳孔對光反射存在，則實驗動物建模成功。

1.3.3取材及組織固定于實驗第5天時將各實驗組大鼠斷頭處死，摘取眼球后置于生理鹽水中沖洗，后置于1%戊二醛和10%甲醛混合溶液中固定，后將眼球自上而下縱切至瞳孔中央，再向內、外各成120°夾角切成三等分，然后在鼻側、顳側、下側各縱行切取一條組織，制成蠟塊〔6〕，留存備用。

1.3.4相關指標計算通過顯微鏡觀察記錄視網膜神經部九層總厚度(簡稱視網膜厚度)、視網膜厚度比(損傷眼/正常眼)、內核層厚度、內核層厚度比(損傷眼/正常眼)。以正常對照眼(左眼)的神經節細胞計數為100%，計算損傷眼(右眼)正常神經節細胞、變性神經節細胞與壞死神經節細胞所占的百分率。

1.4統計學方法采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2　結　果

2.1NGF對缺血大鼠視網膜萎縮的影響對照組大鼠右眼在發生缺血-再灌注損傷后5 d時，可見明顯的視網膜萎縮變化，具體表現為視網膜厚度比減少(P<0.01)，內核層變薄(P<0.05)。然而，經過NGF治療后，大鼠右眼缺血-再灌注損傷得到明顯修復(P<0.01)。治療組NGF 1 000 BU組大鼠右眼視網膜厚度比和內核層厚度比與正常組比較接近，但仍明顯低于正常組，見表1。

2.2NGF對大鼠視網膜神經節細胞缺血壞死的保護作用模型組大鼠右眼在發生缺血-再灌注損傷后5 d時，神經節細胞發生明顯變性壞死，正常神經節細胞計數顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，治療組大鼠視網膜神經節變性和壞死的情況得到明顯修復(P<0.01)，見表2。

表1　NGF對缺血大鼠視網膜萎縮的影響

與模型組比較:1)P<0.01;與正常組比較:2)P<0.05,3)P<0.01，下表同

表2　NGF對缺血大鼠視網膜神經節細胞的影響及其病變分布

3　討　論

RIRI在臨床上是一種常見的病理生理過程，比如視網膜動脈阻塞、青光眼等疾病均可造成RIRI〔7,8〕。這一過程會嚴重損傷視網膜的結構和功能，使視網膜出現萎縮、內核層變薄的病理變化，同時還可以引起神經節細胞的變性和壞死，嚴重影響患者的生存質量。NGF是一種蛋白質，是神經營養因子家族中的一員，是感覺神經元存活的必需因子〔3〕，在發育期大鼠視網膜神經節細胞上存在NGF的特異性受體，存在高親和力和低親和力之分〔4〕。NGF在神經元的生長、發育和分化方面及其再生和功能性表達等方面發揮關鍵作用，還能減少細胞凋亡的發生，但目前NGF對細胞保護的具體作用機制仍不清楚。

研究發現，NGF可以通過刺激視網膜血管內皮細胞的生長和增殖，促進視神經處血管管腔的形成，從而促進新生血管的形成〔9〕。Tanaka 等〔10〕研究發現大鼠主動脈內皮細胞可以主動分泌和釋放NGF，進一步確認了體內NGF的產生與血管內皮細胞密切相關。此外，Lad等〔11〕研究還發現血管內皮細胞產生并釋放NGF時，體內還會出現NGF的高親和受體TrkA和低親和受體P75NTR的分泌和釋放，從而起到促進體內NGF充分利用，進一步促進視網膜血供的恢復，修復視神經的損傷。Myung-Jin等〔12〕研究發現NGF可促進人臍靜脈血管內皮細胞和人皮膚微血管內皮細胞體外增殖和遷移，表現出劑量效應關系，這一研究進一步說明了NGF具有促進內皮細胞增殖和促進血管生長的作用。牛膺筠等〔7〕研究顯示，缺血再灌注損傷24 h后視網膜神經節細胞數量明顯減少。本研究提示NGF具有防止缺血損傷引起的視網膜萎縮的效果；另外，內核層主要由雙極細胞構成，眼睛缺血損傷可明顯導致內核層變薄，提示雙極細胞數量明顯減少，本研究顯示NGF能夠有效對抗這一損傷，并表現出對雙極細胞生長和增殖的促進作用。由于視神經節細胞對缺血造成的損傷極為敏感，并占節細胞層細胞數的90%以上，在缺血-再灌注這一病理過程中會出現變性和壞死表現，本研究提示NGF對視神經節細胞由于缺血造成的損傷具有較強修復和保護作用。

1王棟,劉子瑞,劉宏偉,等.CNTF與NGF對視神經損傷模型大鼠視網膜神經節細胞的影響〔J〕.黑龍江醫藥科學,2014;37(6):61-2,65.

2Perlman JI,Mccole SM,Pulluru P,etal.Disturbances in the distribution of neurotransmitters in the rat retina after ischemia〔J〕.Curr Eye Res,1996;15:589-96.

3Levi-Montalcini R，Hamburger V.A diffusible agent of mouse sarcoma producing hyperplasia of sympathetic ganglia and hyperneurotization of viscera in the chick embryo〔J〕.J Exp Zool,1953;123:233-87.

4Zanellato A,Comell MC,Dal TR,etal.Developing rat retinal ganglion cells express the functional NGF receptor p140trka〔J〕.Dev Biol,1993;159(1):105.

5Roy J,Blazar BR,Ochs L.The tissue expression of cytokine in human acute cutaneous graft-versus-host disease〔J〕.Transplantation,1995;60:343-8.

6王軍志,饒著明,吳勇杰.神經生長因子對大鼠視網膜缺血-再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國生物制品學雜志,1998;11(2):107-9.

7牛膺筠,趙穎,賈新國,等.視網膜缺血再灌注損傷后HSP70、NF-KB的表達和細胞凋亡的關系〔J〕.眼科研究,2005;23(4):377-9.

8Ozbay D,Ozden S,Muftuoglu S,etal.Protective effect of ischemic preconditioning on retinal ischemia-reperfusion injury in rats〔J〕.Can J Ophthalmol,2004;39(7):727-32.

9王丁丁,于強,陳子林,等.神經生長因子對人視網膜血管內皮細胞的影響〔J〕.中山大學學報(醫學科學版),2010;31(1):45-9.

10Tanaka A,Wakita U,Kambe N,etal.An autocrine function of nerve growth factor for cell cycle regulation of vascular endothelial cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2004;313(4):1009-14.

11Lad SP,Peterson DA,Bradshaw RA,etal.Individual and combined effects of TrkA and p75NTR nerve growth factor (NGF) receptors:a role for the high affnity receptor site〔J〕.J Biol Chem,2003;278(27):24808-17.

12Myung-Jin P,Hee-Jin K,Hyung-Chahn L,etal.Nerve growth factor induces endothelial cell invasion and cord formation by promoting matrix metalloproteinase-2 expression through the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway and AP-2 transcription factor〔J〕.J Biol Chem,2007;282(42):30485-96.