Adv-GFP標記的骨髓間充質干細胞輸注對肝癌中TGF-β1、PDCD4及c-fos的影響

胡澤楠　任　茜　嚴　俊　周永寧

(蘭州大學第一醫院消化科，甘肅　蘭州　730000)

肝癌是常見的惡性腫瘤，目前尚缺乏行之有效的方法輔助手術切除的肝癌患者自我修復〔1〕。骨髓間充質干細胞(BMSCs)由于來源豐富，具有多方向分化的潛能，而展現出良好的應用前景〔2〕。BMSCs歸巢的特性，也為輸注輔助治療肝癌提供了新策略〔3,4〕。本研究采用腺病毒轉染標記綠色熒光的BMSCs輸注，觀察輸注BMSCs對肝癌是否有保護作用。

1　材料與方法

1.1材料健康雄性SD幼鼠，實驗操作符合動物倫理學要求。主要儀器及試劑：酶標儀(TECAN sunrise)、低溫超高速離心機(Thermo)、熒光顯微鏡(Zeiss)、恒冷箱切片機(Shandon)、低糖DMEM培養液(hyclone)、胎牛血清(FBS，Sigma)、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml。

1.2方法

1.2.1BMSCs的體外分離、培養將成年雄性SD大鼠泡在碘酒中消毒處死,剝離皮膚和肌肉，取出兩側股骨，剪斷兩端。用L-DMEM 培養液反復沖洗骨髓腔,收集沖洗液,接種到涂有多聚賴氨酸的50 ml 培養瓶中,并置入37℃、5%CO2培養箱中培養。以后每隔2 d進行換液。當細胞長滿培養瓶時,進行傳代培養。用D-Hank液清洗細胞表面,0.25% 胰酶(0.02%EDTA) 消化1 min后，用含血清的培養液終止消化。等到90%的細胞從貼壁狀態轉化為懸浮狀態，吹打細胞，并收集細胞懸液,1 000 r/min離心5 min后,用含10%FBS的培養液重新懸浮細胞。將細胞接種至兩個培養瓶中繼續培養。當細胞再長滿瓶底時,同樣按照上述方法進行傳代。

1.2.2BMSCs的標記鑒定獲取P3～P5代BMSCs，去除培養液后，用D-Hank漂洗1次，用0.25%胰酶(0.02% EDTA) 消化至細胞懸浮后，再用含血清的培養液終止消化。離心5 min收集細胞。用含血清的培養液重懸細胞后，用計數板計數。計算體積0.5 ml、含3×106mmol/L BMSCs，獲取相應細胞量再離心，后棄上清液。以相應體積的D-Hank培養液重新懸浮BMSCs。將構建好的表達綠色熒光蛋白的腺病毒(Adv-GFP)按MOI200轉染細胞。第2天將標記上GFP的MSCs按3×106mmol/L 0.5 ml尾靜脈注射到大鼠體內。標記上綠色熒光的BMSCs在熒光顯微鏡下拍照鑒定。

1.2.3SD鼠肝癌模型構建和BMSCs輸注及其觀察用含0.02 ppm黃曲霉毒素(AF)B1的飼料喂食大鼠120 d，構建肝癌模型。將建模成功的肝癌大鼠隨機分為對照組和治療組。對照組接受0.5 ml D-Hank輸注。治療組接受含3×106mmol/L，0.5 ml BMSCs的D-Hank輸注。

1.2.4BMSCs輸注2 w后觀察治療效果移植2 w后，檢測兩組中輸注細胞的歸巢情況。SD大鼠用1%的戊巴比妥鈉麻醉后備皮，切開皮膚，在脊柱旁開1 cm處椎旁肌內植入2 mm PLGA支架，去細胞脊髓支架和三維明膠海綿支架。兩組大鼠縫線縫合肌肉及皮膚,術后分組飼養,每日2次肌注抗菌素。每天觀察皮膚手術切口及動物反應變化。于手術后第1周將大鼠灌注，固定：將1%戊巴比妥鈉注射到大鼠腹腔內致死； 剪開胸腔，充分暴露心臟。將灌注針從心室插管至升主動脈，并用鉗子固定針管。同時快速灌注磷酸鹽緩沖液(PBS)120 ml以沖去血液，開始灌注時剪開心耳放血,以形成灌注流，沖洗至肝臟無血色即為沖洗血液干凈。先快速灌注50 ml 4%的多聚甲醛，后慢速灌注250 ml，固定時間控制在至少30 min。取肝臟組織，冰凍切片，片厚30 μm，取組織進行Hoechst33342染色，熒光鏡下計數組織中綠色熒光細胞數目。每組5只動物，每只動物選8張切片進行統計。

1.2.5RT-PCR檢測轉化生長因子(TGF)-β1、程序化凋亡因子PDCD4基因的表達引物設計見表1。使用Trizol法裂解細胞，提取細胞總RNA，進行純度鑒定,將RNA 用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，最后經PCR擴增出相應cDNA。PCR產物最后通過電泳進行半定量。

表1　TGF-β1、PDCD4基因的引物

1.2.6Western印跡檢測c-fos蛋白的表達用10%分離膠分離蛋白，然后濕轉法將蛋白轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下封閉，使用總抗c-fos(abcam,ab48942)一抗孵育過夜，第2天用羊抗兔

辣根過氧化物酶(HRP)孵育1 h后，加入顯色劑，曝光。

1.3統計學方法采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2　結　果

2.1大鼠BMSCs的標記見圖1，第4代細胞中BMSCs形態比較均一，多為長梭形或紡錘狀。將標記有GFP的腺病毒轉染之后，骨髓干細胞在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，細胞形態為長梭形、成纖維細胞樣或多角形，呈放射狀，形成小集落，胞界清楚。經過細胞核Hoechst33342染色，可以觀察到轉染病毒后的細胞狀態良好，可用于體內示蹤標記。

2.2大鼠肝臟中綠色BMSCs的數量見圖2。對照組肝臟中無含綠色熒光標記的BMSCs，而治療組中可以看到切面上有部分綠色熒光的BMSCs(16.1±5.42)，說明標記綠色熒光的BMSCs能夠通過尾靜脈注射歸巢到達肝臟組織中行使某種功能。

圖2　兩組肝臟中綠色BMSCs

2.3大鼠肝臟中TGF-β1和PDCD4基因表達情況對照組肝臟中TGF-β1較高表達(2.93±0.30)、PDCD4基因低表達(0.76±0.36)；治療組接受治療2 w后，TGF-β1表達顯著降低(1.52±0.23)、PDCD4基因表達顯著提高(3.62±0.24，均P<0.05)。

2.4大鼠肝臟中c-fox蛋白表達對照組肝臟中有更高的c-fos蛋白表達(1.18±0.14)，而治療組在接受BMSCs治療2 w后，c-fos蛋白表達顯著降低(0.21±0.07，P<0.05)。見圖3。

圖3　兩組c-fos的蛋白量

3　討　論

肝癌是我國常見高發的惡性腫瘤之一，目前肝癌治療的最有效手段是手術切除，但對于無法進行手術切除及手術切除預后不好的病人，仍然需要尋找更好的輔助手段治療〔4〕。近年來BMSCs由于來源方便，可由病人自身提供，移植后免疫排斥反應低，無倫理爭議，受到了廣泛的關注。BMSCs輸注治療的相關研究很多，如何能夠更好地觀察干細胞的去向成為研究的關鍵〔5～7〕。本研究通過基因手段，將普通的BMSCs改造成為自發綠色熒光的細胞，能更準確地進行標記、追蹤和觀察干細胞，為相關研究提供了新的實驗思路和依據〔8,9〕。本實驗觀察到，尾靜脈注射后，治療組中的BMSCs能夠歸巢到達肝臟。這種歸巢機制十分復雜，有研究發現，通過尾靜脈注射，BMSCs能夠歸巢到心肌梗死老鼠的心肌中，這種歸巢到損傷組織的特性由組織損傷后釋放的多種趨化因子介導〔10〕。

TGF-β1是一種蛋白多肽，具有多種功能，是TGF-β超家族成員之一。在細胞生長、分化、炎癥免疫、調節和損傷修復等方面，TGF-β1都發揮重要作用。在肝細胞增殖調節方面,TGF-β1具有負相調節作用〔11〕。有研究發現正常干細胞無TGF-β1，而在肝癌細胞中TGF-β1 mRNA表達提高，而TGF-β1水平提高也會促進肝癌的進一步侵襲和轉移〔12〕。本研究發現，尾靜脈輸注BMSCs，TGF-β1表達受到抑制，雖然這種抑制并沒能達到零，即達到正常肝臟的零表達水平，但這種表達的下調說明BMSCs輸注能夠有效調節肝臟中TGF-β1表達。

PDCD4基因是一種抑癌基因，具有啟動eIF4A、eIF4G，從而抑制細胞生長的作用。研究發現，癌組織中PDCD4表達下降甚至缺失，提示PDCD4表達上調可能是癌癥受到抑制的標志之一〔13〕。本研究再一次證明了尾靜脈輸注BMSCs具有一定的治療效果。

原癌基因c-fos在細胞生長的靜止期不表達，在有增生的正常肝組織中也能檢測到少量表達，而在癌癥組織的細胞中過度表達，可作為一種探尋癌癥狀態的標志物。c-fos蛋白可與c-jun蛋白形成二聚體AP-1,進一步與DNA結合參與轉錄的過程〔14〕。本課題研究結果說明通過BMSCs尾靜脈輸注能夠從mRNA到蛋白水平逆轉肝臟細胞中的癌癥狀態，這種逆轉可能無法達到正常水平，但是為無法接受肝臟切除的病人或接受肝臟切除病人的預后提供了可能的干預手段。

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