羅格列酮對重癥急性胰腺炎大鼠腎組織中一氧化氮及NF-κB/p65表達的影響

胡雨云　楊成彬　杜鵬輝

(廈門大學附屬第一醫院急診部，福建　廈門　361003)

重癥急性胰腺炎發生后能夠導致腎組織損傷，機體中過量的一氧化氮(NO)對腎組織造成毒性，導致血管對縮血管相關物質敏感性降低，引起腎組織缺氧，產生大量的炎癥因子，加重腎組織損傷〔1〕。羅格列酮是一種過氧化物酶體增殖物活化受體激活劑，而過氧化物酶體增殖物活化受體在創口愈合、細胞生長及炎癥反應中均發揮重要作用〔2〕。羅格列酮在腸炎、感染性休克、缺血損傷等疾病發生過程中發揮抗感染作用，能夠通過作用于核因子(NF)-κB/p65影響炎癥因子的釋放〔3〕。研究表明，羅格列酮能夠減輕急性胰腺炎大鼠肝損傷及胰腺損傷〔4〕。本研究通過構建重癥急性胰腺炎大鼠模型，探討羅格列酮對重癥急性胰腺炎大鼠腎組織的作用。

1　材料與方法

1.1材料SPF雄性Wistar大鼠33只，體重180～220 g，購自廈門大學動物中心。NO含量檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；誘導型一氧化氮合酶(iNOS)酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測試劑盒購自北京綠源博德生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；羅格列酮購自美國Sigma；腫瘤壞死因子(TNF)-α多克隆抗體、細胞間黏附分子(ICAM)-1多克隆抗體、NF-κB/p65多克隆抗體均購自德國GeneTex公司。

1.2重癥急性胰腺炎大鼠模型構建模型構建參照參考文獻〔5〕，所有實驗動物在建模前1 d均禁食過夜，不限制飲水。所有實驗動物按照10 ml/kg進行腹腔注射麻醉(4%水合氯醛)。將實驗動物固定至手術臺上，消毒后在上腹正中切開長2 cm的切口。將十二指腸提取后，找到胰膽管。將肝總管夾閉后，用頭皮針從十二指腸逆行進入腸腔，隨后進入胰管的0.8 cm處，在頭皮針的另外一端用注射器將5%的牛磺膽酸鈉注入，劑量1 ml/kg，速率0.1 ml/min，退針后，保持動脈夾夾閉狀態。觀察胰腺有水腫、充血后，將動脈夾松開，將十二指腸放入腹腔內后縫合。手術結束后，按照2 ml/100 g大鼠體重注射生理鹽水。大鼠蘇醒后，繼續禁食，不限制飲水。

1.3分組實驗分為對照組、模型組和羅格列酮組各11只，對照組只翻動十二指腸，羅格列酮組和模型組按照1.2中進行造模。羅格列酮組在造模前0.5 h腹腔注射1%羅格列酮，劑量1 ml/kg。對照組、模型組用等量10%的二甲基亞砜溶液代替。模型組死亡1只，對照組和羅格列酮組隨機淘汰1只，每組剩余10只。各組大鼠在造模后12 h經4%水合氯醛麻醉后，取腎組織，用于檢測NO含量、iNOS活性、NF-κB/p65表達水平及TNF-α和ICAM-1表達。

1.4NO含量和iNOS活性檢測取大鼠腎組織100 mg，加入冰預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)后，組織勻漿，配制成25%的組織勻漿液，4 000 r/min，4℃離心20 min后，吸取上清液，分為兩部分，一部分根據(硝酸還原酶法)NO含量檢測試劑盒檢測NO含量，另外一部分用ELISA iNOS活性檢測試劑盒檢測iNOS活性。

1.5NF-κB/p65表達檢測各組大鼠麻醉后，處死大鼠，取大鼠腎組織，制作石蠟切片，用濃度梯度酒精脫水后，經檸檬酸抗原修復(切片在pH=6.0的檸檬酸緩沖液中煮沸2 min)，用0.3%過氧化氫溶液特異性地阻斷內源性過氧化氫酶的活性，室溫下孵育10 min。與100倍稀釋的NF-κB/p65抗體在4℃孵育過夜后，與1 000倍稀釋的二抗在37℃孵育反應1 h。顯色后，蘇木素染色2 min。被染成黃色的判定為陽性。隨機選取5個視野，計算陽性細胞數目所占比例。

1.6Western印跡檢測TNF-α和ICAM-1的表達水平取大鼠腎組織，剪碎后，加入裂解液，在冰上裂解后，4℃，12 000 r/min離心10 min，取蛋白上清液，按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白樣品與2倍上樣緩沖液按照1∶1的比例混合，100℃煮沸5 min使蛋白變性。蛋白電泳：每孔加入50 μl樣品，80 V電泳30 min后，調整電壓為120 V至電泳結束。轉膜：4℃轉膜1.5 h，轉膜電壓為90 V。5%牛血清白蛋白封閉后，分別與一抗(500倍稀釋，4℃過夜)、二抗(1 000倍稀釋，室溫反應60 min)反應后，滴加顯色液，以GAPDH為內參，分析蛋白表達情況。

1.7統計學處理采用SPSS22.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.13組腎組織中NO、iNOS水平比較模型組腎組織中NO含量及iNOS活性升高，而羅格列酮作用后能夠部分降低NO含量及iNOS活性(均P<0.05)。見表1。

表1　3組NO含量及iNOS活性比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

2.23組腎組織中NF-κB/p65水平比較對照組、模型組和羅格列酮組NF-κB/p65陽性細胞率依次為(0.86±0.06)%、(3.75±0.11)%、(3.13±0.25)%。模型組腎組織中NF-κB/p65水平升高，羅格列酮作用后能夠部分降低NF-κB/p65水平(均P<0.05)。

2.33組TNF-α和ICAM-1水平比較模型組腎組織中 TNF-α和ICAM-1水平升高，而羅格列酮作用后能夠部分降低TNF-α和ICAM-1水平差異均有統計學意義(均P<0.05)。見圖1，表2。

圖1　Western印跡檢測TNF-α和ICAM-1表達水平

表2　TNF-α和ICAM-1表達水平

3　討　論

過氧化物酶體增殖物活化受體γ是一種核轉錄因子，在生命機體的脂肪組織、肝臟、結腸、脾臟、平滑肌細胞、淋巴細胞等組織和細胞中均廣泛表達，能夠調控脂質和糖代謝過程，并且對細胞的生長、凋亡和分化具有調控作用，在炎癥反應等過程中也發揮重要作用〔6〕。羅格列酮能夠特異性激活過氧化物酶體增殖物活化受體γ，促使其與靶基因結合〔7〕。顧澄宇等〔8〕研究表明，重癥急性胰腺炎大鼠模型經腹腔注射羅格列酮后，RT-PCR檢測發現，過氧化物酶體增殖物活化受體γ的mRNA水平在3～12 h內呈現高表達，并且能夠降低胰腺組織中NO水平，減輕胰腺組織的病理損傷。

NO是由iNOS催化合成的能夠調節血小板凝集、細胞內信號轉導及免疫反應的細胞因子，其中iNOS在炎癥反應中作用最為廣泛〔9〕。Li等〔10〕研究表明，重癥急性胰腺炎大鼠模型胰腺組織中有大量的iNOS存在，而抑制iNOS后，大鼠重癥急性胰腺炎減輕。Xiong等〔11〕檢測重癥急性胰腺炎大鼠模型肝臟和胰腺組織中NO水平發現，NO能夠介導氧化損傷的發生。以上結果均表明，過量的NO能夠加重胰腺炎損傷。本研究結果提示，羅格列酮能夠降低NO水平減輕重癥急性胰腺炎損傷。

NF-κB是一種蛋白質因子，能夠調控細胞內多種基因的轉錄過程，能夠與黏附因子、細胞因子等基因的啟動子特異性結合而促進基因的表達〔12〕。有研究表明，NF-κB能夠促進細胞內TNF-α、白細胞介素(IL)-8等多種炎癥因子的表達，其激活后可以作為炎癥反應過程中多種細胞因子的中心部分，NF-κB/p65是NF-κB激活后的主要存在方式〔13〕。Niyaz等〔14〕研究表明，重癥急性胰腺炎大鼠的胰腺組織中NF-κB活化水平升高，而羅格列酮能夠緩解炎癥，降低胰腺、肝臟等的損傷，下調胰腺組織中ICAM-1的表達水平。da Silva Buss等〔15〕研究表明，羅格列酮能夠降低急性胸膜炎大鼠模型的炎癥反應，減少iNOS、ICAM-1的表達。本研究結果提示，羅格列酮能夠通過降低NF-κB/p65水平，抑制TNF-α和ICAM-1表達而減輕重癥急性胰腺炎腎組織損傷。這可能是羅格列酮減輕重癥急性胰腺炎腎損傷的作用機制之一。

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15da Silva Buss Z,Medeiros YS,Fr?de TS.PPAR-gamma agonist rosiglitazone attenuates the inflammation caused by carrageenan in the mouse model of pleurisy〔J〕.Inflammation,2012;35(1):280-8.