電針對氯苯丙氨酸致失眠大鼠Toll樣受體/核因子-κB信號通路的影響

陳桂容　胡天俊　虞　潔　郭尚函　何揚子

(暨南大學醫學院中醫系，廣東　廣州　510632)

失眠是最常見的睡眠障礙，以睡眠的入睡和維持均有困難為特征的，睡眠數量或質量不能滿足機體正常需求的一種主觀體驗〔1〕。長期失眠不利于人的身心健康，容易降低人體免疫功能，引發各個臟腑器官的功能失調，是高血壓病、糖尿病、潰瘍病、冠心病和某些精神疾病發生的高危因素。針灸以其安全有效無毒副作用的優勢，在臨床上運用廣泛〔2〕。Toll樣受體(TLR)/核因子(NF)-κB信號通路在免疫調節中起到了十分重要的作用。TLR/NF-κB信號通路通過誘導NF-κB的轉位和促進炎癥因子如白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-α、IFN-β等的表達，發揮其在非特異性免疫應答的調節作用。研究表明〔3，4〕，針灸能夠提高失眠患者的免疫功能，提高失眠大鼠IL-1、IL-2、IL-6及TNF-α的含量。有研究發現針灸治療失眠的機制可能與TLR的信號通路有關〔5，6〕。本實驗探討電針治療失眠的機制。

1　材料與方法

1.1動物與分組SPF級雄性Wistar大鼠 16只，體質量(200±20)g，由中山大學(大學城)實驗動物中心提供，醫學動物合格證號：SCXK(粵)2011-0029，NO.44008500008457。將16只大鼠，按隨機數字表法分為對照組、模型組、安定組、電針組，每組4只，正常飼養7 d后予以相應處理。實驗均在8：00～17：00進行，環境要求安靜、通風、室溫26℃左右。實驗過程中對動物的處理均遵照“關于善待動物的指導性意見”。

1.2主要試劑及儀器戊巴比妥鈉購自北京化學試劑公司，批號：69020100；氯苯丙氨酸(PCPA)購自日本TCI公司，批號：H110130000；地西泮(安定)注射液購自天津金耀氨基酸有限公司，批號：1401161；穗鑫牌針灸針購自蘇州市華倫醫療用品有限公司，批號：140401； RnaEx與ddH2O購自上海杰瑞生物工程有限公司；Quant cDNA第一鏈合成試劑盒與 SYBR Green熒光定量 PCR 試劑盒購自天津根生化科技有限公司。KWD-808電針儀為常州市英迪電子醫療器械公司產品。

1.3實驗操作PCPA按文獻〔7〕，臨用前把PCPA粉末用弱堿性生理鹽水配置成質量濃度為 20 g/L懸混液。①將模型組、安定組、電針組大鼠按質量分數為45 mg/100 g體質量的標準進行腹腔注射，每日1次，連續2 d。在第1次腹腔注射PCPA 28～30 h后，大鼠出現晝夜節律消失，而對照組正常，表明模型復制成功。②第3～7天模型組大鼠不予任何干涉，正常飼養。③安定組第3～7天進行腹腔注射安定注射液，采用成人催眠劑量(10 mg/d)，根據人鼠給藥劑量體表面積折算公式，算得0.92 mg/kg是大鼠的給藥劑量，每日1次。④電針組大鼠第3～7天予電針神庭、百會穴治療，20 min/d，1次/d。百會、神庭穴在大鼠上的具體定位參照《常用實驗動物針灸穴位圖》，百會：大鼠頭部頂骨正中，兩耳連線中點；神庭：大鼠額頂骨縫交界線前方處，頭部前正中線上。電針操作：用0.25.00 mm×25 mm的無菌針斜刺進針，3～5 mm，隨后連接上KWD-808型電針儀，選取連續波型，頻率10 Hz，電壓6 V。⑤對照組大鼠第1～7天不做任何處理，正常飼養。實驗過程中，每天對大鼠進行體重檢測。

1.4標本采集、檢測方法實驗結束后，各組大鼠禁食過夜，用腹腔注射體積分數2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。無菌條件下切取其脾臟，冰上分離脂肪等雜質，稱體質量，脾臟迅速放入液氮冷凍，再在-80℃冰箱保存，提取RNA，取50～100 mg脾臟組織加入0.3 ml的RnaExTM試劑，使用組織搗碎機破碎細胞5～20 s(2～3次)；再將0.7 ml的RnaExTM試劑加入其中，混勻，室溫下靜置5 min。加入氯仿0.2 ml，漩渦振蕩混勻，于室溫下靜置2 min。4℃，12 000 r/min離心10 min。放置EP管時，方向必須一致。按1∶1的比例，分別各取400 μl取上清液和異丙醇置于無菌無酶的1.5 ml EP管中，充分混勻，-20℃放置20 min。4℃，12 000 r/min離心10 min，小心棄去上清。將1 ml 75%乙醇加入管中，上下倒置混勻，4℃，12 000 r/min離心5 min，小心棄去上清。再加入1 ml 75%乙醇，上下顛倒混勻，4℃，12 000 r/min離心5 min，小心棄去上清。再次4℃，12 000 r/min離心1 min，用黃槍頭吸取殘留液體，勿接觸沉淀。開蓋晾干3 min，讓殘存的乙醇揮發殆盡，加50 μl DEPC水用手指輕彈管底溶解RNA，室溫下放置10 min。使用微量核酸分光光度計測RNA濃度和純度，較好的R值應在1.8～2.2范圍內，取1 μg RNA 進行按25 μl反應體系進行反轉錄，按照RT試劑盒進行操作。從GenBank里查找基因TLR3、TLR4、MyD88、TAB2及NF-κB序列號，引物由上海銳捷生物工程有限公司設計和合成，內參基因為β-actin。TLR3上游引物：5′-ACCTGATGACCTTCCCTCTA-3′，下游引物：5′-GCAAGTTGGCTGTATCTCGT-3′；TLR4上游引物5′-GGAGGCACATCTTCTGGA-3′，下游引物5′-GGTCATAGTTGTTGCTTCTT-3′；TAB2上游引物5′-TGAAGTGCCTGAAGTTGTT-3′，下游引物5′-TCATGTGATTGCGTAGACC-3′；MyD88上游引物5′-CGACGCCTTCATCTGCTAC-3′，下游引物5′-CCATGCGACGACACCTTT -3′；NF-κB上游引物5′-AAGCACTGTGAGGACGGC-3′，下游引物5′-CGTGAAGTATTCCCAGGTT-3′；內參β-actin上游引物：5′-CCTAGACTTCGAGCAAGAG-3′，下游引物：5′-GGAAGGAAGGCTGGAAGA-3′。PCR按照試劑盒說明書進行操作，取2 μl cDNA按SYBR Green熒光定量PCR試劑盒在冰上配制PCR反應液，將引物與反轉錄產物在20 μl反應體系中進行PCR擴增。PCR 擴增條件：起始模板95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火延伸34 s，40個循環。

1.5統計學處理采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2　結　果

實驗中，大鼠在經過2 d的PCPA造模后出現晝夜活動不停，易受聲音、光刺激而躁動不安，睡眠-覺醒周期紊亂，提示造模成功。經電針和安定干預之后的大鼠則睡眠-覺醒周期得到恢復，白天安靜倦臥，逐漸恢復到正常。模型組較對照組大鼠脾臟TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表達明顯增高(P<0.05)，提示大鼠失眠可能與TLR/NF-κB信號通路上調有關。安定組和電針組較模型組TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表達顯著下降(P<0.05)，提示電針可能是通過下調TLR/NF-κB信號通路mRNA表達，抑制IL-2、IL-6、TNF-α等細胞因子的釋放，起到改善機體失眠的作用，見表1。

表1　電針對失眠模型大鼠脾臟TLR3、TLR4、MyD88、TAB2、NF-κB mRNA表達的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3　討　論

TLRs家族的信號傳導高度相似于IL-1R家族，其特點是依賴胞內區的激酶和接頭蛋白分子進行信號傳導。由于接頭蛋白有差異，TLRs在胞內的信號傳導途徑可有2條：①MyD88 依賴型途徑〔8〕。MyD88依賴性信號轉導途徑較為經典，TLR4是其中典型代表。在此途徑中，NF-κB通路最終被其激活從而發揮作用。TLRs與配體結合，由于MyD88羧基末端的Toll/IL受體(TIR)結構域與結合體的二聚化其胞質區的TIR結構域具有同源性，會相互結合，然后活化MyD88，活化后的MyD88通過其氨基末端的死亡結構域(DD)作用于IL-1受體相關激酶(IRAK)氨基端，導致IRAK自身磷酸化。接著與TNF受體相關因子(TRAF)6發生作用，活化TRAF6與轉化生長因子β活化激酶1(TAK1)及TAK1的結合蛋白(TAB)形成復合物，NF-κB誘導激酶(NIK)被激活，IκB激酶(IKKs)復合物得到磷酸化，磷酸化IKKs作用于IκB最終IκB磷酸化降解，使IκB/NF-κB復合物中釋放出NF-κB，釋放出來的NF-κB得到激活，繼而移位到細胞核內〔9〕。 NF-κB可結合多種靶基因例如TNF和IL的啟動子，啟動其轉錄激活，這些細胞因子作為信號語言，最終激活機體的特異性免疫系統，在調節免疫、細胞增殖、分化及凋亡中發揮作用。②TRIF 依賴型途徑〔8〕。TLR3、TLR4均可通過此途徑進行信號傳導〔10〕。此途徑與 MyD88 依賴途徑大體類似，差異在于其接頭蛋白，此途徑的接頭蛋白是TIRAP或MAL，TIRAP是一種TIR包含分子，MAL是一種MyD88樣分子，最終形成TLR-TIRAP/MAL8-IRAK2 復合體〔11〕。

本實驗表明失眠激活了TLR/NF-κB信號通路，引起炎癥因子 IL-1、IL-6、IL-12和TNF-α等分泌的增加，與相關研究〔12，13〕失眠使大鼠血清細胞因子IL-6、IL-2 和TNF-α含量升高是相符的。機體感染時，體內的免疫系統被激活，抵抗病原體的侵入，引起發熱和促進睡眠，而睡眠會影響免疫細胞和細胞因子的活性，可見睡眠與免疫功能之間是相互影響的〔14，15〕。有研究發現睡眠不足可抑制刀豆蛋白(Con)A、脂多糖(LPS)誘導的脾細胞增殖反應〔16〕，失眠可引起外周血淋巴細胞對有絲分裂原刺激的增殖反應降低，NK細胞活性降低，多形核粒細胞的吞噬功能降低，機體的免疫功能則下降。在本實驗中，失眠激活了大鼠TLR/NF-κB信號傳導通路，其TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB mRNA表達增強，其TLR3、TLR4、MyD88 、TAB2及NF-κB分子的合成增多，促使各種細胞因子分泌增加，機體的免疫功能開啟。TLR/NF-κB信號通路的激活一方面可以誘導強烈的免疫應答，有利于機體抵抗病原微生物的感染；另一方面其過度的激活則過度表達炎性因子，損害機體的健康，引起心肌損傷和自身免疫性疾病〔17〕，還會促進腫瘤特別是炎癥相關腫瘤的發生、轉移和免疫逃逸〔18〕。本實驗失眠大鼠經電針和安定干預后，其上述基因mRNA下降，各細胞因子的過度分泌得到抑制，在改善大鼠睡眠質量的同時，其機體的免疫功能也恢復正常。

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