女貞子提取物對大強度耐力訓練力竭后大鼠肝組織自由基代謝的影響

張　輝

(南京審計大學體育部，江蘇　南京　211815)

女貞子具有補腎滋陰、養肝明目的藥理作用〔1〕。女貞子果實中含有多種抗氧化活性物質，易溶于乙醇、甲醇、丙酮等有機溶劑，并且可間接影響機體的自由基代謝活動，其中齊墩果酸是其中最主要的脂溶性抗氧化物質〔2〕。女貞子既往研究多針對女貞子提取物對機體的抗氧化效應〔3，4〕，對自由基代謝影響的研究還尚未深入。本研究主要探究女貞子提取物對大強度耐力訓練力竭后大鼠肝組織自由基代謝的影響。

1　材料與方法

1.1實驗小鼠隨機選取SD雄性8周齡大鼠45只，體重(20.00±5.32)g，動物飼養房溫度為(23 ± 5)℃，相對濕度為50%～70%，由專業飼養員進行飼養，提供正常的飲用水和飼料，適應性飼養7 d后進行耐力訓練。

1.2女貞子活性物質的提取女貞子采自陜西，經中國科學院植物研究所鑒定。活性物質提取步驟：將采摘的女貞子果實潔凈晾干后放于恒溫烘箱中烘干，用研缽粉碎過40目篩后存放在干燥處備用。稱取果實研碎粉末30 g置于錐形瓶中，按固液比1∶10的比例分別加入95%乙醇，同時采用靜置、攪拌、加熱回流等手段使溶劑與原料充分接觸。最后，經長時間浸泡使原料中的化學成分溶解于溶劑中。

1.3實驗動物分組及訓練在耐力訓練前將45只大鼠隨機分為安靜組、運動組、實驗組各15只。耐力訓練前，分別給安靜組和運動組小鼠灌胃1 ml生理鹽水，給實驗組大鼠灌胃1 ml女貞子提取物，每天1次，持續7 d。之后對運動組和實驗組小鼠進行6 w的耐力訓練，每天訓練前以15 m/min的速度做適應性運動5 min后再進行正式訓練，訓練模型根據實際情況調整的Bedford模型〔5〕。安靜組小鼠不做處理，繼續適應性喂養，保持正常的生理活動。

1.4制備大鼠肝組織樣本經過6 w耐力訓練后，斷頭處死大鼠，取大鼠肝臟后用濾紙吸干，稱重，將大鼠肝臟研磨制備10%勻漿液，4℃，3 500 r/min離心5 min，取上清液，置于4℃冰箱保存待測。

1.5活性物質檢測

1.5.1黃嘌呤氧化酶法測超氧化物歧化酶(SOD)活性〔6〕準備好測定管和對照管，在測定管中加好試劑和待測樣品，對照管中不加任何待測樣品。黃嘌呤氧化酶法試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，測定操作方法遵照試劑盒說明書。用漩渦振蕩器充分混勻，置37℃水浴30 min。在兩管中分別加入1ml顯色劑，混勻，室溫放置10 min，蒸餾水調零，測A530。SOD活力(U/ml)=(A2-A1)/A2×100%÷50%×反應體系的稀釋倍數×樣本測試前的稀釋倍數，A1：測定管的吸光值；A2：空白管的吸光值。

1.5.2Fe2+與菲啉類物絡合法測定總抗氧化能力(T-AOC)〔7〕T-AOC檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。對照說明書在試管中加入相應試劑和100 μl肝組織勻漿，漩渦混勻器混勻，37℃水浴30 min，加入蒸餾水100 μl，測其吸收度。對照試管中加入相應試劑后加入100 μl蒸餾水，測其吸光度。T-AOC=(測定管OD-對照管OD)/0.01/30×稀釋倍數。

1.5.3鉬酸銨法測定過氧化氫酶(CAT)活性〔8〕配制65 mmol/L H2O2基液(過氧化氫酶測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供)。CAT檢測：設置空白管、自身對照管、測定管，空白管中只加入CAT Assay buffer和65 mmol/L H2O2基液，自身對照管和測定管中則加入待測樣品和65 mmol/L H2O2基液。立即混勻，置于水浴，準確孵育。每管中加入1 ml MO顯色液。分光光度計檢測405 nm處吸光度。組織樣品CAT活力(U/mg)=〔(A自身對照-A測定)/A測定〕×650/待測樣品血紅蛋白濃度(mg/ml)。

1.5.4TBA比色法測丙二醛(MDA)含量〔9〕將上述上清液用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，以便于后續計算單位蛋白重量組織細胞內的MDA含量。MDA檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。提前配制TBA工作液置于4℃避光保存。在離心管加入勻漿上清液、裂解液、磷酸鹽緩沖液(PBS)、生理鹽水等適當溶液做空白對照(注意：待測樣品為血清、血漿時，標準品應用生理鹽水稀釋；待測樣品為勻漿液時用相同溶液稀釋)。隨后加入4.14 ml MDA檢測工作液。將上述試劑混勻，水浴煮沸。水浴冷卻至室溫，離心。取上清，蒸餾水調零，用分光光度計或酶標儀檢測523 nm或535 nm處吸光值。MDA濃度(μmol/mg)=(OD測定-OD空白)/(OD標準-OD空白)×10蛋白質質量濃度(mg/ml)。

1.5.5比色法檢測大鼠肝組織乳酸脫氫酶(LDH)活性〔10〕丙酮酸溶液及NADH溶液放在25℃水浴中預熱。取一只比色杯中加入磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液，置于紫外分光光度計中，在340 nm處將光吸收調節至零。取另一只比色杯用于測定LDH活性，依次加入丙酮酸鈉溶液和NADH溶液，加蓋搖勻后，測定340 nm吸光值(A)。隨后，取出比色杯，加入經稀釋的酶液10 μl，搖勻，每隔5 min測A340 nm。LDH活力(U/ml)=(A340 nm×稀釋倍數)/(酶液加入量)×10-1。LDH活性檢測采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。

1.6統計學方法采用SPSS22.0軟件進行方差分析。

2　結　果

2.1各組體質量、力竭時間及肝組織質量的變化比較注射女貞子提取物或耐力訓練后，相對安靜組，運動組力竭游泳時間和體質量增加，但差異無統計學意義(均P>0.05)。而運動組肝組織質量相對安靜組增加顯著(P<0.05)。實驗組力竭游泳時間和體質量相對安靜組、運動組顯著增加(均P<0.05)，肝組織質量雖有增加，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　各組體質量、力竭時間變化比較

與安靜組比較：1)P<0.05；與運動組比較：2)P<0.05；下表同

2.23組各指標活性變化運動組SOD、T-AOC、CAT活性相對安靜組有一定下降，差異有統計學意義(P<0.05)，而MDA、LDH活性有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。實驗組SOD、T-AOC、CAT活性相對安靜組、運動組有一定提高，MDA、LDH活性有所下降，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2　女貞子提取物對實驗大鼠肝組織SOD、T-AOC、CAT、MDA、LDH活性的影響

3　討　論

機體日常生命活動過程中會產生大量的自由基，尤其在進行耐力運動后，自由基過多對人體造成一定副作用〔11〕，其對人體的攻擊首先從細胞膜開始，細胞膜極富彈性和柔韌性，電子極容易丟失，細胞膜彈性及其相關功能均隨之喪失。由于細胞生理結構遭到破壞，機體就會出現各種疾病〔12〕。此外，自由基還會攻擊蛋白質并對基因進行破壞，參與機體生命活動的蛋白質酶類遭受侵襲導致機體代謝紊亂，進而導致基因突變。

本研究顯示運動和服用女貞子提取物均能影響機體參與自由基代謝相關酶類的活性，從而間接影響大鼠肝組織的自由基代謝反應。SOD是一種源于生命體的活性物質，是一種很好的抗氧化物質，能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質，人體不斷補充SOD會有一定的抗衰老效果〔13，14〕。T-AOC反映機體的總抗氧化能力，代表體系中大小分子和酶總和的水平，適當運動背景下，機體自由基代謝處在相對平衡的狀態，SOD活性和T-AOC會得到加強，但耐力訓練之后機體自由基代謝紊亂，活性和抗氧化能力自然會有所下降。CAT是一類催化能力極強的過氧化氫酶和氧化還原酶，以鐵卟啉為輔基，CAT能催化體內的過氧化氫分解反應，能清除自由基〔15，16〕，在維持細胞氧化與抗氧化活性物質的平衡上具有重要意義。耐力運動后，CAT活性減弱，這可能是由于力竭運動后機體產生了過量的過氧化氫，而過氧化氫能與CAT的-SH結合，從而消耗大量的CAT，破壞了細胞氧化與抗氧化的平衡。在小鼠或人體中，氧自由基反應和脂質過氧化反應在機體代謝中起著重要作用，脂質過氧化反應會形成脂質過氧化產物如MDA等，MDA是機體發生脂質過氧化反應的產物，其含量可反映脂質過氧化程度，同時也反映了細胞的受損程度〔17〕，力竭運動后，MDA含量相對有所上升，說明機體發生了大量的過氧化反應，這可能是因為機體由于自由基代謝紊亂，抗過氧化酶類活性下降，增強了機體的過氧化反應。LDH是一種糖酵解酶，存在于機體所有組織細胞的胞質內，是機體內無氧呼吸過程的主要酶類，與無氧運動有關，耐力運動后，LDH活性上升，主要是因為耐力運動過程中進行無氧呼吸，產生了大量的乳酸原因。

女貞子含有多種抗氧化活性物質，以齊墩果酸抗氧化功能尤為顯著〔18〕，齊墩果酸是一種齊墩果烷型五環三萜類化合物，存在于大量飲食和藥用植物中，具有抗氧化、抗感染、保護心臟、抗菌、抗病毒的藥理作用。給大鼠灌服女貞子提取物后，在進行耐力運動的過程中產生了大量的自由基，由于女貞子提取物中含有大量的抗氧化物質，阻礙了機體發生氧化反應，同時也可清除運動過程中產生的大量自由基，維持了機體氧化與抗氧化的平衡，使得自由基代謝能夠有條不紊進行。本研究結果顯示，女貞子提取物可維持機體自由基代謝的平衡，提高機體的抗氧化能力，提取物中的抗氧化活性物質除了可以起到抗氧化的作用外還有許多的藥理作用，能控制人體其他的病理過程，具有比較好的保健作用。

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