變異冬紅果無菌體系的建立

韋 晨，王 醒

(1.江蘇大學，現代農業裝備與技術教育部重點實驗室，江蘇鎮江 212013；2.江蘇藝軒園林景觀工程有限公司，江蘇鎮江 212000)

冬紅果(Malusspectabilis)是薔薇科蘋果屬落葉灌木或小喬木，因其掛果期可延至第2年2—3月，故又名長壽果。冬紅果喜陽光充足和涼爽干燥的環境，適宜在含腐殖質豐富、疏松肥沃、排水良好的沙質土壤中生長；植株較矮小，樹型緊湊，花淺粉紅色，傘房花序，春季開放；果實呈簇狀，圓球形或扁圓形，秋季成熟，果色初為綠色，后轉黃色，最后呈鮮紅色，具有較高的觀賞價值，是培育觀果盆景的極佳樹種[1-2]。江蘇大學現代農業裝備與技術教育部重點實驗室在冬紅果的栽培過程中發現1株變異冬紅果，該變異株不僅葉片呈紫色，而且果實初期亦呈紫色，至深秋果色由紫入紅，寓意萬紫千紅，前期的紫葉紫果既增添了色彩變化的多樣性，滿足了人們對觀賞植物新、特、奇的要求，又在一定程度上使得觀果期向前延伸，因此，具有這一特異性狀的冬紅果變異植株更具市場潛力。

采用傳統的嫁接繁育技術不僅使變異冬紅果優良性狀難以保存，而且使繁殖效率較低，極大地限制了變異冬紅果的優樹選育和規?；瘮U繁。而組織培養繁殖方法，不僅可對變異母本的優良性狀進行保持、提純或復壯，而且離體培養下繁殖體個體小、群體大，且可控的環境還能消除季節因素的限制，從而顯著地提高繁殖系數[3-4]。因此，組織培養繁殖方法在變異冬紅果的繁殖方面優勢明顯。目前有關冬紅果組織培養快繁技術的報道鮮見。而對蘋果屬植物組織培養進行消毒處理時，大多會選用75%乙醇和0.1%或0.05%氯化汞消毒，也有用0.1%氯化汞單獨消毒，均能達到很好的消毒效果[5-8]。另外，為達到相同的消毒效果，通常隨消毒劑濃度的降低，消毒時間逐漸延長。如在研究不同消毒方法對辣木外植體的影響時，結果表明氯化汞濃度越低，消毒時間越長，才與短時間高濃度的氯化汞溶液達到相似的消毒效果，否則，污染率相對較高[9]。但是，不同種類的蘋果屬植物組培時，無論是消毒劑種類及其濃度選擇，還是消毒時間的確定，均存在一定差異，因此對于每一種蘋果屬植物均需通過一系列的篩選比較，優化出較為適宜的消毒方法。筆者以變異冬紅果莖段為外植體，比較不同消毒劑濃度和消毒時間，研究其無菌體系的建立，以期為變異冬紅果增殖和生根培養奠定基礎。

1　材料與方法

1.1供試材料以采自江蘇藝軒園林景觀工程有限公司的1株變異冬紅果新萌發的帶芽莖段為外植體；消毒試劑為乙醇和氯化汞。

1.2試驗方法

1.2.1外植體的處理與清洗。剪取變異冬紅果新抽生的嫩枝，除去葉片，留取4 cm左右帶腋芽的莖段，用洗衣粉水浸泡3～5 min，流水下沖洗30～60 min，沖洗干凈后備用。

1.2.2外植體的消毒。乙醇(75%)、氯化汞(0.1%)配合使用進行消毒，消毒后用無菌水沖洗3～4次；使用氯化汞(0.1%)消毒 6、7、8、9 min，消毒后用無菌水沖洗3～4次；當消毒劑濃度降低時，為達到相同的消毒效果，需要相應地延長消毒時間，因此，使用氯化汞(0.05%)選取的消毒時間為10、15、20、25 min，消毒后用無菌水沖洗3～4次。

1.2.3接種。在超凈工作臺上將消毒過的外植體切成帶腋芽長度為1～2 cm的莖段，將莖段接入芽誘導培養基中。每瓶接種1個莖段，每個處理接種30個帶芽莖段，重復3次。

1.2.4培養條件。 培養溫度為24～26 ℃，光照時間為10 h/d，光照強度為1 800～2 200 lx。

1.3統計方法培養7 d后統計污染情況；培養30 d后統計褐化死亡率和成活率。

污染率=污染的外植體數/接種的外植體數×100%

褐化死亡率=死亡褐化的外植體數/接種的外植體數×100%

成活率=成活的外植體數/接種的外植體數×100%

2　結果與分析

2.1乙醇與氯化汞不同時間配合處理對外植體的影響由表1可知，乙醇與氯化汞結合消毒對污染有一定的控制作用，但兩者結合消毒，可能破壞了莖段的生長點，導致成活率不高。從污染率來看，隨著0.1%氯化汞消毒時間的增加，污染率逐漸降低。從死亡率來看，隨著消毒時間的增加，褐化死亡率也在逐漸增加。從成活率來看，75%乙醇和0.1%氯化汞作為消毒劑，隨著0.1%氯化汞消毒時間的延長，成活率呈先上升，然后逐漸下降的趨勢。當0.1%氯化汞消毒時間超過12 min后，成活率為0；當 0.1%氯化汞消毒時間為 10 min 時，成活率最高，但僅為 38.89%。因此，當乙醇與氯化汞結合消毒時，變異冬紅果莖段較適宜的消毒方法為75%乙醇30 s+0.1%氯化汞10 min。

表1乙醇與氯化汞對變異冬紅果莖段的消毒效果

Table1DisinfectioneffectofalcoholandmercuricchloridsonmutantMalusspectabilisstemsection%

組號GroupNo.處理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate175%乙醇30s+0.1%氯化汞7min33.3344.4422.22275%乙醇30s+0.1%氯化汞8min22.2250.0027.78375%乙醇30s+0.1%氯化汞9min16.6752.2231.11475%乙醇30s+0.1%氯化汞10min5.5655.5638.89575%乙醇30s+0.1%氯化汞11min4.4473.3322.22675%乙醇30s+0.1%氯化汞12min3.3396.670775%乙醇30s+0.1%氯化汞15min0100.000

2.2氯化汞(0.1%)不同消毒時間對外植體的影響由表2可知，從污染率來看，隨著0.1%氯化汞消毒時間的延長，污染率逐漸降低。同時，從褐化死亡率來看，隨著消毒時間的增加，雖然污染率降低了，但死亡率在逐漸增加。從成活率來看，隨著0.1%氯化汞消毒時間的延長，成活率呈先上升，然后逐漸下降的趨勢，當0.1%氯化汞消毒時間為 8 min 時，成活率最高，為50.00%，褐化死亡率為 20.00%。因此，用0.1%氯化汞消毒較為適合的消毒時間為8 min。

表2氯化汞(0.1%)對變異冬紅果莖段的消毒效果

Table2Disinfectioneffectof0.1%mercuricchlorideonmutantMalusspectabilisstemsection%

組號GroupNo.處理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate10.1%氯化汞6min72.2211.1116.6720.1%氯化汞7min41.1116.6742.2230.1%氯化汞8min22.2220.0050.0040.1%氯化汞9min20.0038.8941.11

2.3氯化汞(0.05%)不同消毒時間對外植體的影響由表3可知，降低氯化汞的濃度并延長消毒時間，有效提高了變異冬紅果莖段的成活率。隨著0.05%氯化汞消毒時間的延長，污染率顯著降低。從褐化死亡率來看，隨著消毒時間的延長，褐化死亡率緩慢增長。從成活率來看，隨著0.05%氯化汞消毒時間的延長，成活率整體較高，呈先升高再降低的趨勢，當0.05%氯化汞消毒時間為 20 min 時，成活率最高，可達71.11%，褐化死亡率為11.11%。因此，用0.05%氯化汞消毒較為適合的消毒時間為20 min。

表3氯化汞(0.05%)對變異冬紅果莖段的消毒效果

Table3Disinfectioneffectof0.05%mercuricchlorideonmutantMalusspectabilisstemsection%

組號GroupNo.處理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate10.05%氯化汞10min66.674.4428.8920.05%氯化汞15min35.566.6757.7830.05%氯化汞20min17.7811.1171.1140.05%氯化汞25min11.1133.3355.56

3　結論與討論

通過以上研究可以發現，消毒劑和消毒時間的選擇對變異冬紅果莖段無菌體系的建立有很大的影響，通過3種消毒方式比較，結果表明最佳的消毒方式為0.05%氯化汞消毒20 min，污染率為17.78%，褐化死亡率為11.11%，成活率為71.11%；其次為0.1%氯化汞消毒8 min，污染率為22.22%，褐化死亡率為20.00%，成活率為50.00%；而75%乙醇30 s結合0.1%氯化汞10 min消毒，污染率為5.56%，褐化死亡率為55.56%，成活率為38.89%，效果最差。相比其他蘋果屬植物莖段的消毒處理，消毒方法和消毒時間仍有很大差異。垂絲海棠帶芽嫩莖適宜用75%乙醇(20～30 s)和0.3%氯化汞(2～3 min)結合消毒[10]；木瓜海棠帶芽嫩莖適宜用75%乙醇(30 s)和0.1%氯化汞(8～15 min)結合消毒[11]；來安花紅水培外植體莖段適宜用70%乙醇(30 s)和0.1%氯化

汞(4 min)結合消毒，野外采集的外植體莖段適宜用70%乙醇(30 s)和0.1%氯化汞(7 min)結合消毒[12]；貼梗海棠帶芽嫩莖適合用75%乙醇(45 s)和0.1%氯化汞(8 min)結合消毒[13]，也有研究表明貼梗海棠莖段適合用0.1%氯化汞(7～15 min)消毒[14]。由此可知，短時間和低濃度的氯化汞消毒更適合變異冬紅果莖段，但氯化汞消毒時間過短，只能除去表面細菌，無法除去內源菌，而氯化汞濃度過高或消毒時間太長，則可能會對莖段組織細胞產生毒害作用，使細胞活性降低，甚至死亡[15]。因此，針對不同的蘋果屬植物，需要篩選不同的消毒劑和消毒時間，從而比較出較適宜的消毒方法。

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