美洲大蠊黃酮提取工藝條件研究

程吉云，岳 明，王 濤，周文靖，許 龍

(佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154007)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.),俗稱蟑螂、偷油婆、灶螞子等，其蟲體內(nèi)含有極豐富的營養(yǎng)和功能性成分，包括蛋白質(zhì)、維生素、幾丁質(zhì)等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類物質(zhì)在醫(yī)學(xué)上具有許多作用，如抗癌、增強(qiáng)免疫能力、保護(hù)心腦血管等，黃酮類物質(zhì)成為天然活性成分研究的重點(diǎn)對象之一[1]。研究資料表明，植物體內(nèi)含有豐富的黃酮類物質(zhì)，但是動(dòng)物體內(nèi)含量相對較少，尤其是昆蟲體內(nèi)研究的較少。為研究如何從昆蟲體內(nèi)最大劑量地提取活性最大的黃酮物質(zhì)，筆者以美洲大蠊為研究對象，通過分析不同提取溫度、不同提取時(shí)間和不同料液比對美洲大蠊體內(nèi)黃酮提取率的影響，參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-8]，確定最佳提取條件，期望為美洲大蠊的相關(guān)研究提供理論支撐。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。該試驗(yàn)所使用的美洲大蠊來自于河北省國中藥材市場，經(jīng)羅志文副教授鑒定為美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)隸屬于蜚蠊目(Blattaria)鱉蠊科(Corydidae)，該藥材及樣品被保存在佳木斯大學(xué)的應(yīng)用昆蟲研究所。

1.1.2主要儀器與試劑。TU-1800/800S型紫外線可見分光光度計(jì)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵； HHW-21CU-600電熱恒溫水槽及電熱鼓風(fēng)干燥箱；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(索氏抽提器)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；石油醚；甲醇；正丁醇等。

1.2方法

1.2.1原料處理。美洲大蠊分揀較嚴(yán)格，要求不含雜質(zhì)。將分揀好的美洲大蠊置于冰箱速凍后使用電熱鼓風(fēng)箱進(jìn)行干燥處理(溫度設(shè)定為55～60 ℃)。將干燥的美洲大蠊粉碎過60～80目，然后使用石油醚對美洲大蠊粉末進(jìn)行脫脂處理。

1.2.2黃酮液的提取。準(zhǔn)確稱取美洲大蠊粉制品3.33 g置于抽提器中，并在其中加入石油醚3.34 mL。將抽提器置于70 ℃恒溫水浴鍋中，提取脂肪，濾除濾渣。在室溫環(huán)境下使用100 mL 濃度為50%的甲醇將其浸泡36 h，每3 h對其搖動(dòng)1次，繼續(xù)抽濾，使用提取溶劑反復(fù)對濾渣進(jìn)行洗滌3次。最后將濾液合并，舍棄濾渣，待濾液中的甲醇揮發(fā)后定容于100 mL的容量瓶中。

1.2.3黃酮含量的測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用50%甲醇轉(zhuǎn)溶于50 mL容量瓶，并定容至刻度，得0.20 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確吸取0、1、2、3、4、5 mL上述溶液置于10 mL容量瓶內(nèi)，分別加入0.3 mL 5%等體積亞硝酸鈉溶液，振蕩搖勻后靜置5 min，分別加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后再靜置5 min，再加入4%氫氧化鈉4.0 mL，最后用50%甲醇稀釋定容，靜置30 min，用紫外可見分光光度計(jì)測定波長496 nm的吸光度值。采用DSP數(shù)據(jù)處理軟件處理，得到工作曲線回歸方程：A=0.011 6C+0.013 7(C為濃度，μg/mL；A為吸光值；相關(guān)系數(shù)R=0.995)，見圖1。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

采用移液管吸取上述樣品提取液0.1 mL滴入10 mL的容量瓶內(nèi)，再向該容量瓶中加入5%亞硝酸溶液各0.3 mL，輕輕振蕩容量瓶保證溶液均勻后靜置5 min。再加入濃度為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，同樣輕輕振蕩容量瓶后靜置5 min。再加入濃度為4%的氫氧化鈉溶液4.0 mL，輕輕振蕩后采用濃度為50%的甲醇分別稀釋后定容，輕輕晃動(dòng)搖勻后靜置30 min。用紫外分光光度計(jì)測定該溶液在波長496 nm波長下的吸光度值A(chǔ)，使用相應(yīng)的公式計(jì)算黃酮含量。

1.2.4不同因素提取試驗(yàn)。使用不同的溫度、時(shí)間、料液比分別對脫脂后的美洲大蠊粉末中的黃酮物質(zhì)進(jìn)行提取，測定所提取黃酮的含量，并將其換算為100 g干黃酮的提取率。

2　結(jié)果與分析

2.1提取溫度對黃酮提取率的影響由圖2可知，提取溫度在美洲大蠊黃酮的提取過程中扮演著十分重要的角色。該試驗(yàn)過程所使用的酒精濃度為90%，提取時(shí)間固定為8 h，分別使用不同料液比[1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)]對美洲大蠊中黃酮的成分進(jìn)行提取。提取溫度設(shè)定在25～65 ℃，可以看出隨著溫度的提升，美洲大蠊的黃酮提取率逐漸增高。雖然溫度對黃酮提取率有影響，但是黃酮提取率所受影響程度不太大，并且5種不同料液比條件下，黃酮提取率受溫度影響程度比較一致。綜合考慮溶解度和能耗等因素，最后確定美洲大蠊黃酮提取溫度確定為25 ℃。

圖2　提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.2　Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.2提取時(shí)間對黃酮提取率的影響圖3顯示的是提取溫度為25 ℃，料液比為1∶4(g/mL)的條件下，使用濃度不同的乙醇對黃酮進(jìn)行提取，黃酮提取率隨提取時(shí)間的變化過程。可以看出，提取時(shí)間對美洲大蠊黃酮類化合物的提取率具有明顯的影響。隨著提取時(shí)間的推進(jìn)，乙醇不斷溶解更多的黃酮類化合物。當(dāng)乙醇濃度在55%～65%時(shí)，當(dāng)提取時(shí)間超過12 h之后，黃酮類化合物的提取率變化比較緩慢；當(dāng)乙醇濃度為75%～90%時(shí)，在提取時(shí)間為4～12 h范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮提取率顯著增加，但超過24 h后，黃酮提取率變化不明顯。因此得出，美洲大蠊黃酮最佳提取時(shí)間為12 h。

圖3　提取時(shí)間對黃酮提取率的影響Fig.3　Effect of extraction time on the extraction rate of flavone

2.3料液比對黃酮提取率的影響提取液的配比對黃酮提取率也會(huì)產(chǎn)生明顯的影響。圖4顯示的是乙醇濃度為90%、提取溫度為25 ℃條件下，不同料液比提取黃酮的試驗(yàn)過程，提取時(shí)間分別為8、12、 24、 48 h。可以看出提取時(shí)間的增加會(huì)在一定程度上提升黃酮類化合物的提取率；并且隨著料液比的增多，美洲大蠊黃酮類化合物的提取率也在逐漸提升。同時(shí)也可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，料液比為1∶4～1∶8(g/mL)，美洲大蠊黃酮提取率的變化最為明顯；當(dāng)料液比超過1∶8(g/mL)時(shí)，美洲大蠊黃酮提取率的變化逐漸趨于平穩(wěn)。

圖4　料液比對黃酮提取率的影響Fig.4　Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

隨著料液比的提升，提取時(shí)間為8 h條件下，提取的美洲大蠊黃酮含量變化較大，隨著提取時(shí)間的增加，其提取率變化不明顯。

由圖4可以看出，12～48 h階段，美洲大蠊黃酮類提取率的變化趨勢比較接近，且變化幅度不大；縱向分析圖4可以看出，料液比為1∶8～1∶12(g/mL)，黃酮類化合物的提取率變化緩慢，增幅較小。因此，綜合考慮各種因素最終確定美洲大蠊黃酮最佳提取料液比為1∶8～1∶12(g/mL)。為了節(jié)省成本，可將料液比縮小至1∶8(g/mL)。

3　結(jié)論與討論

美洲大蠊含有的黃酮類化合物比較豐富，每100 g含量在1 600.0～1 970.0 mg，因此對美洲大蠊黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行研究具有十分積極的意義。

通過對不同提取溫度、不同提取時(shí)間和不同料液比的黃酮提取效果進(jìn)行對比分析，綜合考慮各種因素，最終確定美洲大蠊黃酮類化合物最佳提取條件為提取溫度為25 ℃，提取時(shí)間為12 h，料液比為1∶8(g/mL)。

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