檸檬皮中檸檬苦素的提取及其抑菌穩定性研究

張 貝，白衛東，2，馮衛華，2*，曾曉房，2，于立梅，韓 珍，陳利紅

(1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東廣州 510225；2.廣東中興綠豐發展有限公司，廣東河源 517000；3.廣東省梅州市飛龍果業有限公司，廣東梅州 514000)

檸檬是蕓香科柑橘屬的主要品種，它富含維生素 C、檸檬橙和鈉元素等，經常食用檸檬可以防止消化不良、降脂、預防腫瘤和改善血液循環等功效，因此，檸檬也被稱為世界上最有藥用價值的水果之一[1]。我國是檸檬種植最大的地區，檸檬的產業發達，但由于檸檬皮與籽含有苦味，通常被當作生活垃圾丟棄。隨著國內外學者的深入研究，發現檸檬皮與籽中的檸檬苦素含量豐富，檸檬苦素是植物次生代謝時生成的一類含呋喃環且高度氧化的四環三萜類化合物，存在于柑橘屬多種植物中，迄今為止已分離出大約300種檸檬苦素類化合物[2]，據研究表明有明顯的抗腫瘤、鎮痛、抗炎等藥理作用[3]，也是引起柑橘類果汁味苦的主要物質[4]。研究人員已從柑橘屬中分離出37種檸檬苦素類似物和22種配糖體[5-6]。目前，人們對檸檬苦素的研究主要集中在蕓香科植物各種屬及不同部位檸檬苦素的提取工藝、含量、抑菌活性、抗氧化性及其在食品工業應用等方面，檸檬苦素和其他檸檬苦素類化合物均可作為大部分農作物的殺蟲劑、拒食劑、生長調節劑，而這些檸檬苦素類化合物還可提高其他生物殺蟲劑和常規殺蟲劑的效果[7-9]。

目前，我國對于檸檬苦素的研究還處于初級階段，研究主要集中在檸檬苦素在植物各組分中的含量及其抗氧化性、抑菌性等方面。日本、美國已報道了檸檬苦素類物質制作功能性食品和飲料的專利，我國對其生理活性和開發利用的報道甚少，而檸檬苦素在市場上的需求卻明顯增加，所以開發檸檬苦素具有十分重要的現實意義。筆者利用正交優化方案，得到一種高效快速在檸檬果皮中提取檸檬苦素的方法，同時以其提取液對7種菌進行抑菌試驗篩選，旨在為檸檬的開發利用和檸檬苦素的高效提取提供理論依據和參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。檸檬皮粉，由廣東中興綠豐發展有限公司提供。檸檬苦素標準品、石油醚、無水乙醇、對-二甲氨基苯甲醇、濃硫酸、三氯化鐵、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、根霉、青霉和黑曲霉。細菌：營養瓊脂培養基，營養肉湯培養基；霉菌：PDA培養基，馬鈴薯葡萄糖水培養基。

1.1.2主要儀器。電子天平、電熱干燥箱、UV759紫外可見分光光度儀、THZ-82冷凍水浴恒溫振蕩器、牛津杯、無菌超凈工作臺、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、SP-250生化培養箱、SPH-103B恒溫培養搖床。

1.2提取方法

1.2.1提取工藝流程。新鮮檸檬皮烘干→磨粉，過40目篩→60 ℃石油醚浸泡2 h脫脂→90%乙醇浸提→真空旋蒸→二氯甲烷除雜→旋蒸得結晶。

1.2.2正交試驗設計。以乙醇為提取劑，以提取劑濃度、提取料液比和浸提時間3個單因素進行L9(34)正交試驗，所得檸檬苦素提取液以檸檬苦素含量為指標確定最佳提取工藝，正交試驗因素水平設計見表1。

表1　正交試驗因素水平設計

1.2.3顯色劑Ehrlich試劑的配制。A液：準確稱取125 mg 對-二甲氨基苯甲醛溶于100 mL硫酸乙醇溶液中(濃硫酸65 mL，無水乙醇35 mL，放冷使用)；B液：準確稱取三氯化鐵9.0 g，蒸餾水定容至100 mL。使用時在A液中加入0.05 mL B液，現配現用。

1.2.4檸檬苦素含量的測定。檸檬苦素標準品以無水乙醇配成250 μg/mL的標準工作溶液，在6支試管中分別加入0、0.5、0.8、1.2、1.5、2.0標準溶液，分別加入無水乙醇至2.0 mL，再分別加入5.0 mL顯色試劑Ehrlich試劑搖勻，在室內靜置30 min避免陽光直射，在波長500 nm下測定分光度。以檸檬苦素空白為參比，測定其吸光度，以檸檬苦素含量為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.3抑菌性試驗

1.3.1菌懸液制備。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌接種到營養肉湯培養基中，于37 ℃下培養1 d備用，將根霉、青霉和黑曲霉接種到馬鈴薯葡萄糖水培養基中，于28 ℃下培養2 d備用。

1.3.2抑菌試驗。 牛津杯法：用無菌移液槍取1 mL菌懸液與50 ℃已滅菌的10 mL培養基在無菌培養基中，充分搖晃混勻，常溫下靜置至培養基凝固后，取對角位置安放4個滅菌的牛津杯，分別加入20 μL檸檬苦素，分別在28和37 ℃下培養1和2 d，觀察抑菌圈直徑大小，重復3次取平均值。

1.3.3紫外線對抑菌活性的影響。用無菌移液槍取1 mL菌懸液與50 ℃已滅菌的10 mL培養基在無菌培養基中，充分搖晃混勻，常溫下靜置至培養基凝固后，取對角位置安放4個滅菌的牛津杯，分別加入在紫外線下處理0、10、15、20、25、30 min的最小抑菌濃度的檸檬苦素提取液20 μL，分別在28和37 ℃下培養1和2 d，觀察抑菌圈直徑大小，重復3次取平均值。

1.3.4pH對抑菌活性的影響。用無菌移液槍取1 mL菌懸液與50 ℃已滅菌的10 mL培養基在無菌培養基中，充分搖晃混勻，常溫下靜置至培養基凝固后，取對角位置安放4個滅菌的牛津杯，分別加入將pH調為2.7、4.0、6.0、8.0的最小抑菌濃度的檸檬苦素提取液20 μL，分別在28和37 ℃下培養1和2 d，觀察抑菌圈直徑大小，重復3次取平均值。

1.3.5溫度對抑菌活性的影響。用無菌移液槍取1 mL菌懸液與50 ℃已滅菌的10 mL培養基在無菌培養基中，充分搖晃混勻，常溫下靜置至培養基凝固后，取對角位置安放4個滅菌的牛津杯，分別加入經常溫、45、60、80、121 ℃熱處理15 min的最小抑菌濃度的檸檬苦素提取液20 μL，分別在28和37 ℃下培養1和2 d，觀察抑菌圈直徑大小，重復3次取平均值。

2　結果與分析

2.1提取正交試驗結果取去脂烘干的檸檬皮粉樣品9份，各5 g，以提取劑濃度、提取料液比和浸提時間3個單因素做正交提取試驗，結果見表2。

表2檸檬果皮中檸檬苦素提取的L9(34)正交試驗

Table2OrthogonaltestofL9(34)extractionoflimonininlemonpeel

試驗號TestNo.因素Factor乙醇濃度(A)Ethanolconcentration料液比(B)Solid-liquidratio時間(C)Extractiontime區組(D)Block檸檬苦素含量Limonincontentmg/g(DW)1111139.4042122242.7873133343.3554212343.2685223142.2486231242.2357313241.2948321345.3839332147.555k141.84941.32242.34143.069k242.58443.47344.53742.105k344.74444.38242.29942.639R2.8953.0602.2380.964

根據正交試驗可以得出，料液比為影響檸檬苦素提取的最大因素，其次是乙醇濃度，提取時間又次之，即B>A>C，由于最佳提取條件包括在正交試驗9組試驗中，所以不需要進行驗證試驗。因此，檸檬苦素最佳提取條件為A3B3C2，即乙醇濃度90%，料液比1∶40(g/mL)，提取時間 120 min；最優提取條件下，檸檬皮粉檸檬苦素的提取理論值為47.555 mg/g(DW)。

2.2抑菌試驗結果

2.2.1最小抑菌濃度確定。將檸檬苦素提取液以二氯甲烷萃取除雜后真空旋蒸，再稀釋成一定倍數的10%無水乙醇溶液，以15%無水乙醇做空白對照，結果見表3。

表3　各菌種最小抑菌濃度

從表3可以看出，檸檬苦素對這7種菌都有一定抑制效果，且由抑菌圈直徑大小可以看出對霉菌的抑制效果遠大于細菌。

2.2.2紫外線處理對抑菌活性的影響。將最小抑菌濃度的檸檬苦素在紫外線下處理0、10、15、20、25、30 min，分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、根霉、青霉和黑曲霉，培養一定時間后，觀察抑菌圈直徑大小，平行3次測定結果見圖1。

圖1　紫外線處理對抑菌活性的影響Fig.1　Effect of UV treatment on bacteriostatic activity

從圖1可知，隨紫外線處理時間增加，因紫外線照射破壞了檸檬苦素和細菌的抑菌活性，導致霉菌抑菌圈直徑呈現出大體下降的趨勢，而細菌抑菌圈先下降后在15 min時回升，但達不到未處理時的直徑大小。可能是因為提取液為化合物，紫外線激發了其他檸檬苦素類物質的抑菌活性，導致抑菌效果再次增強。由圖1可看出，紫外線處理對檸檬苦素的抑菌效果影響較大。

2.2.3pH處理對抑菌活性的影響。將最小抑菌濃度的檸檬苦素以緩沖劑調整pH至2.7、4.0、6.0、8.0，分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、根霉、青霉和黑曲霉，培養一定時間后，觀察抑菌圈直徑大小，平行3次測定結果見圖2。

圖2　pH處理對抑菌活性的影響Fig.2　Effect of pH treatment on bacteriostatic activity

從圖2可以看出，檸檬苦素在酸性條件下抑菌效果更好，在pH>6以后幾乎對3種細菌無抑制效果，對霉菌pH偏酸性時隨pH增大而抑制效果減弱；但在pH>6以后，因使其他抑制劑的活性減弱，提取液中其他物質的抑菌效果增強。

2.2.4溫度處理對抑菌活性的影響。將最小抑菌濃度的檸檬苦素在室溫，分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、根霉、青霉和黑曲霉，培養一定時間后，觀察抑菌圈直徑大小，平行3次測定結果見圖3。

圖3　溫度處理對抑菌活性的影響Fig.3　Effect of temperature treatment on bacteriostatic activity

從圖3可以看出，隨著溫度逐漸升高，抑制了檸檬苦素的活性，導致檸檬苦素的抑菌效果顯著降低，在80 ℃以后，由于高溫破壞了檸檬苦素類物質的活性，已基本失去抑菌效果。

3　結論

檸檬皮中檸檬苦素類物質以90%乙醇溶液在料液比為1∶40(g/mL)、提取溫度為60 ℃、提取120 min的條件下，提取量可達到47.555 mg/g，對比令紅艷等[7]的研究結果萃取溫度為188.3 ℃，物料粒徑為71.3目，料液比值為1∶23.3(g/mL)工藝更簡單快捷，且檸檬苦素提取率更佳。檸檬苦素類物質抑菌穩定性受溫度影響較大，隨著溫度升高對細菌霉菌的抑制效果降低，在80 ℃已基本無效果；對霉菌的抑制效果受紫外線照射時間影響，隨照射時間增加而抑菌活性降低；對4種細菌在酸性條件下抑制效果更佳，隨pH上升活性減弱，在pH>6時基本無抑制效果。

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