MicroRNA-29a對人正常滋養細胞遷移和侵襲功能的影響及其可能的機制

莫玉俏，盧敏，陳小菊

（海南省人民醫院 產科，海南 海口 570311）

子癇前期是妊娠期特有疾病，以妊娠20周后出現高血壓、蛋白尿為主要特征，可伴有全身多器官功能的損害或衰竭，嚴重患者可以出現抽搐、昏迷甚至死亡[1]，對孕產婦和圍生兒造成嚴重危害。子癇前期的發病機制尚不明確[2]，但子癇前期患者的臨床癥狀在胎盤娩出后消失的這一現象提示發育異常的胎盤在子癇前期發病過程中扮演著重要角色[3]。目前認為滋養細胞的侵蝕不良與子癇前期患者存在的胎盤淺著床和螺旋動脈重鑄障礙密切相關[4]。

MicroRNA（miRNA）是一類存在于生物體中可以調控基因表達的內源性非編碼小分子RNA，通過降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻譯對靶基因進行調節[5]。近年來研究表明，子癇前期患者胎盤組織及外周血中存在著大量異常表達的miRNA[6-7]，影響滋養細胞的增殖、侵襲等生物學功能，與子癇前期的發生發展密切相關[8-10]。miR-29a是較早發現的miRNA之一，miR-29a在多種腫瘤中表達異常，并且與腫瘤細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力密切相關[11-14]，但miR-29a對滋養細胞遷移、侵襲等細胞生物學功能是否有影響尚不明確。近期LI等[15]在對子癇前期孕婦與正常孕婦的血漿miRNA表達譜進行比較時發現，子癇前期孕婦血漿中miR-29a表達增高，并應用實時聚合酶鏈反應（real-time PCR）進行了驗證，但miR-29a在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達情況尚不明確。本研究檢測miR-29a在子癇前期和正常孕婦胎盤組織中的表達情況，在體外建立高表達miR-29a的滋養細胞系模擬子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a的高表達狀態，并分析過表達miR-29a對滋養細胞遷移、侵襲能力的影響，以探討miR-29a在子癇前期發生發展中可能的作用機制。

1　資料與方法

1.1　一般資料

選擇2015年1月-2016年1月在海南省人民醫院產科住院行剖宮產分娩的30例子癇前期孕婦為研究對象，并選擇同期30例行剖宮產分娩的正常孕婦作為對照組。所有孕婦均為單胎初產，無煙、酒等特殊嗜好，無內外科合并癥及其他產科合發癥。子癇前期的診斷標準參照第8版《婦產科學》[16]。本次研究報醫院倫理委員會批準，告知研究事項后均簽署知情同意書。胎盤娩出后，在母體面胎盤中央區以以臍帶為中心剪取大小約1 cm×1 cm×1 cm的胎盤組織，避開機化、鈣化或出血灶。將所有收集的組織在離體20 min內置于液氮速凍，-80℃保存備用。

1.2　細胞與試劑

人正常滋養細胞系HTR8/Svneo購自ATCC中國細胞庫。hsa-miR-29amimics及mimics-NC均購自上海吉凱基因公司，逆轉錄試劑盒及real-time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，miR-29a及U6引物由上海吉凱基因公司設計合成，Trizol試劑和脂質體2000（LipofectamineTM2000）購自美國Invitrogen公司，鼠抗人ITGB1、GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠IgG均購自美國Abcam公司，Transwell小室購自美國Costar公司，Matrigel膠購自美國BD公司。

1.3　方法

1.3.1生物信息學分析采用TargetScan（www.targetscan.org）和miRanda（www.microrna.org）生物信息學在線預測軟件分析miR-29a的靶基因。

1.3.2細胞培養人正常滋養細胞系HTR8/Svneo培養在含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養箱中培養，細胞呈貼壁生長。

1.3.3細胞轉染取對數生長的HTR8/Svneo細胞接種于6孔板培養，細胞密度至60%～70%，嚴格按Lipofectamine 2000試劑盒操作說明書進行轉染操作，將miR-29a mimics及陰性對照（mimics-NC）轉染HTR8/Svneo細胞，實驗分為miR-29a mimics組（轉染miR-29a mimics的HTR8/Svneo細胞）、mimics-NC組（轉染 mimics-NC的HTR8/Svneo細胞）及空白對照組（未進行轉染操作的自然生長HTR8/Svneo細胞）。

1.3.4real-time PCR檢測胎盤組織及細胞系miR-29a的表達使用TRizol試劑從組織或細胞中提取總RNA，測定濃度及純度合格后，嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書操作進行逆轉錄合成cDNA。取cDNA按Real-PCR試劑盒說明書配置反應體系進行real-time PCR反應，反應條件：預變性94℃ 2 min，變性94℃20 s，退火延伸60℃ 30 s，擴增40個循環。以U6作為內參基因，實驗重復3次，miR-29a表達量數值采用2-△△Ct法計算。

1.3.5Western blot檢測轉染后HTR8/Svneo細胞ITGB1蛋白的表達收集對數生長期的細胞，用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白樣品濃度。每孔取40μg蛋白上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳30 min，加入5%脫脂奶粉溶液，室溫封閉2 h后，加入適當濃度一抗，4℃反應過夜后，次日洗膜后，再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜后，將膜置于ECL化學發光中，凝膠成像系統顯影，以ITGB1蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示ITGB1蛋白的相對表達量。

1.3.6劃痕實驗檢測轉染后HTR8/Svneo細胞遷移能力的變化取轉染24 h后各組HTR8/Svneo細胞，用10μl槍頭在孔板中心軸處沿直線輕輕劃痕，PBS洗去漂浮細胞后繼續培養，培養24 h，在顯微鏡下觀察拍照記錄0和24 h時刻劃痕間距，以細胞劃痕愈合百分比表示各組細胞的遷移能力。

1.3.7Transwell侵襲實驗檢測轉染后HTR8/Svneo細胞侵襲能力的變化將Matrigel基質膠包被Transwell小室基底膜，收集轉染24 h后各組HTR8/Svneo細胞，向上室加入含5×104個細胞，稀釋于不含胎牛血清的RPMI1640培養液中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，37℃、5%二氧化碳CO2飽和濕度培養24 h后取出，棉簽擦凈基質膠及上室面未遷移的細胞，甲醛固定，0.5%結晶紫染色，隨機選取顯微鏡下5個不同視野計數穿出細胞數，取平均值，實驗重復3次。

1.4　統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間均數比較采用t檢驗，3組間均數比較采用單因素方差分析，采用SNK-q檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1　兩組孕婦臨床特征的比較

兩組患者在年齡、分娩孕周等臨床特征方面比較差異無統計學意義（P＞0.05），而在血壓、新生兒出生體重等方面比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見附表。

2.2　兩組孕婦胎盤組織中miR-29a的表達水平

Real-time PCR結果顯示，子癇前期組孕婦胎盤組織中miR-29a表達水平高于對照組孕婦，差異有統計學意義（t=66.489，P=0.000）。見圖1。

2.4　miR-29a靶基因的預測

通過TargetScan 和miRanda生物信息學在線預測軟件預測miR-29a的靶基因，從2個軟件得到的結果進行交集分析預測并綜合分析，預測ITGB1是miR-29a的1個潛在靶基因，該基因的3’UTR中存在與miR-29a互補的結合位點。見圖2。

2.5　轉染后HTR8/Svneo細胞miR-29a的表達

Real-time PCR檢測各組細胞miR-29a表達水平，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=1 230.78，P=0.000），各組miR-29a表達水平有差別；進一步兩兩比較顯示，miR-29a mimics組細胞miR-29a的表達水平高于mimics-NC組和空白對照組（q=60.862，P=0.000；q=60.667，P=0.000）；mimics-NC組miR-29a的表達水平與空白對照組比較，差異無統計學意義（q=0.196，P=0.903）。見圖 3。

2.6　轉染后HTR8/Svneo細胞ITGB1蛋白表達水平的變化

Western blot檢測各組細胞ITGB1蛋白表達水平，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=31.200，P=0.004），各組ITGB1蛋白表達水平差異有統計學意義；進一步兩兩比較顯示，miR-29a mimics組細胞中ITGB1蛋白表達低于mimics-NC組和空白對照組（q=9.369，P=0.001；q=9.954，P=0.000）；mimics-NC組ITGB1蛋白的表達水平與空白對照組比較，差異無統計學意義（q=0.586，P=0.213）。見圖4。

附表　兩組孕婦臨床特征 （n =30，±s）

附表　兩組孕婦臨床特征 （n =30，±s）

組別　　年齡/歲　　分娩孕周/周　　收縮壓/mmHg　　舒張壓/mmHg　　新生兒出生體重/kg對照組　29.3±3.2　39.0±2.8　117.8±9.1　73.5±9.2　3 689±458.0子癇前期組　28.8±2.7　37.9±2.1　153.3±14.5　95.1±11.9　3 145±752.0 t值　0.654 　1.721 　11.358 　7.865 　3.384 P值　0.516 　0.091 　0.000 　0.000 　0.001

2.7　轉染后HTR8/Svneo細胞遷移能力的變化

圖1　胎盤組織中miR-29a的相對表達量

圖2　miR-29a靶基因的預測

圖3　3組HTR8/Svneo細胞中miR-29a的相對表達量

圖4　3組HTR8/Svneo細胞ITGB1蛋白的相對表達

劃痕實驗顯示3組細胞的劃痕愈合百分比分別為：miR-29a mimics組（50.2±4.4）%，mimics-NC組（75.6±4.6）%，空白對照組（76.1±5.1）%，3組比較差異有統計學意義（F=59.350，P=0.000）。進一步兩兩比較顯示，miR-29a mimics組細胞劃痕修復能力低于mimics-NC組和空白對照組（q=13.212和13.472，均P=0.000）；mimics-NC組和空白對照組比較，差異無統計學意義（q=0.260，P=0.301）。見圖5。

2.8　轉染后HTR8/Svneo細胞侵襲能力的變化

侵襲試驗顯示3組細胞穿入下層小室的細胞數目分別為：miR-29amimics組（22±5）個/HP，mimics-NC組（65±10） 個 /HP；空 白 對 照 組（61±11）個/HP，3組比較差異有統計學意義（F=41.290，P=0.000）。進一步兩兩比較顯示，miR-29a mimics組細胞數少于mimics-NC組和空白對照組（q=11.632和10.550，均P=0.000）；mimics-NC組和空白對照組比較，差異無統計學意義（q=1.082，P=0.189）。見圖6。

圖5　3組HTR8/Svneo細胞劃痕愈合百分比

圖6　3組HTR8/Svneo細胞侵襲實驗細胞數目

3　討論

子癇前期是妊娠期孕婦合并癥，是孕產婦及圍生兒死亡的主要原因，具體的發病機制至今尚不明確，阻礙了該疾病的預后和治療。目前較一致的看法認為血管重鑄不足和胎盤功能障礙與子癇前期有關，其中胎盤滋養細胞浸潤功能下降是導致胎盤淺著床和螺旋動脈重鑄失敗的原因之一。近年來研究發現，子癇前期孕婦胎盤與正常孕婦胎盤相比，存在著一些特異性、異常表達的microRNA，提示microRNA表達的變化可能參與的子癇前期的發生發展，為探索子癇前期的發病機制提供了新的思路。

miR-29a位于染色體7q32.3負鏈的普通型脆性位點FRA7H內，目前有關miR-29a在惡性腫瘤方面的研究較多。LIU等[11]在研究中發現，miR-29a通過靶向ROBO1調控胃癌細胞的遷移侵襲功能。HAN等[12]發現miR-29a通過靶向CEACAM1調控肺腺癌細胞的增殖、遷移及侵襲行為。但miR-29a是否與滋養細胞的遷移、侵襲功能相關，目前尚未見報道。本研究發現miR-29a在子癇前期孕婦胎盤組織中表達水平較正常孕婦增高，因此推測miR-29a的高表達可能與滋養細胞遷移侵襲能力的下降有關。

為了驗證miR-29a的高表達與人正常滋養細胞遷移侵襲能力的關系，本研究應用細胞轉染技術，對人正常滋養細胞HTR8/Svneo轉染miR-29a模擬物后，細胞中miR-29a表達水平增高，成功模擬了子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a的高表達狀態，同時劃痕實驗和Transwell侵襲實驗證實人正常滋養細胞HTR8/Svneo中miR-29a表達水平增高后，細胞的遷移和侵襲能力出現相應的下降，證實子癇前期孕婦胎盤組織miR-29a的高表達與其滋養細胞遷移侵襲能力下降有關。

進一步研究miR-29a調控人正常滋養細胞遷移侵襲的機制，本研究應用目前常用的miRNA靶基因預測軟件TargetScan 和miRanda對miR-29a的靶基因進行預測，綜合分析，最終選定ITGB1作為候選靶基因進行研究。本研究發現對人正常滋養細胞HTR8/Svneo轉染miR-29a模擬物后，細胞中miR-29a表達水平增高，Western blot顯示ITGB1蛋白表達水平降低，說明miR-29a與ITGB1之間存在負向調控關系，后續的實驗將通過雙熒光素酶報告基因實驗對miR-29a與ITGB1之間的靶向調控關系進行進一步的驗證。ITGB1是細胞黏附分子家族中重要的一類分子，是介導細胞與細胞外環境（如細胞外基質、ECM等）之間連接的跨膜受體，并且其可以促進基質金屬蛋白酶的活化及分泌，降解ECM，促進細胞的遷移與侵襲[17-18]。JIANG等[19]通過基因芯片技術發現ITGB1、UBB、PIK3R1、MAPRE1及VEGFA基因參與了子癇前期的病理進程。LI等[20]在研究中通過real-time PCR證實子癇前期孕婦胎盤組織中ITGB1、MCL1、MMP2及VEGFA的表達水平較健康對照組降低，提示子癇前期孕婦胎盤組織中ITGB1的表達降低與子癇前期密切相關。子癇前期孕婦胎盤組織中miR-29a的高表達負向調控ITGB1的表達，造成ITGB1低表達，從而使滋養細胞遷移及侵襲能力下降，參與子癇前期的發生發展。

綜上所述，miR-29a在子癇前期孕婦胎盤組織中高表達，增高滋養細胞miR-29a表達能降低滋養細胞遷移及侵襲能力，其調控機制可能與miR-29a對ITGB1的表達的負向調控有關，為子癇前期發病機制的研究及子癇前期的診療提供了新的思路。

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