α-硫辛酸對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及其可能的機制*

張小歡 ，毛彥穩(wěn) ，彭偉 ，王圓圓 ，劉麗榮 ，劉玲伶 ，石明雋，肖瑛，湯磊，郭兵

（1.貴州醫(yī)科大學 病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學 重大疾病發(fā)病機制及藥物防治特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院檢驗科，貴州 貴陽 550004；4.貴州醫(yī)科大學 藥學院，貴州 貴陽 550004）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見的嚴重微血管并發(fā)癥之一，DN晚期的主要病理特征包括腎小球硬化和腎小管間質纖維化。而氧化應激（oxidative stress，OS）在DN的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[1]。在正常生理狀態(tài)下，適量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）能迅速被腎組織內抗氧化物質（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等）清除；在糖尿病或高血糖環(huán)境時，ROS產生增多而清除減少，體內聚集大量的ROS便可誘導腎臟固有細胞發(fā)生氧化應激，產生大量過氧化代謝產物（如丙二醛等）；并且可以誘導胞內相關信號通路的激活，經核內轉錄因子介導促纖維化生長因子（如轉化生長因子、結締組織生長因子等）基因轉錄和高表達，最終出現細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積而形成腎臟纖維化[2-3]。而轉化生長因子（transforming growth factor β1，TGF-β1）信號通路是目前公認的與糖尿病腎臟纖維化密切相關的信號通路，主要通過誘導腎小管上皮細胞向間充質細胞轉化（epithelial mesenchy-mal transition，EMT），促使ECM合成增加并抑制其降解而過度沉積，從而造成廣泛的腎臟纖維化[4]。而核轉錄共抑制因子（Skirelated novel protein，SnoN）是 TGF-β1信號通路的負性調控因子，可以通過抑制TGF-β1信號通路來延緩腎臟纖維化進程。研究表明[5]，α-硫辛酸（alpha lipoic acid，ALA）是一種含硫的抗氧化劑，可以清除活性氧和自由基，對氧化應激引起的組織損傷有治療作用。因此，本研究旨在觀察抗氧化劑ALA對DM大鼠腎臟的保護作用，并探討其是否通過調節(jié)SnoN表達和TGF-β1信號通路來發(fā)揮對腎臟的保護作用，以進一步了解ALA的作用機制，為DN的防治提理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物健康清潔級雄性Sprague-Dawley大鼠，體重（180±20）g，共24只；由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，批號為SCXK（京）2009-0004。

1.1.2主要試劑ALA（中國奧立寶公司），鏈脲菌素（Streptozotocin，STZ；美國Sigma公司），總抗氧化物酶活性（total antioxidant capacity，T-AOC）、總超氧化物歧化酶活性（total superoxide dismutase，T-SOD）、過氧化氫酶活性（Catalase，CAT）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）試劑盒（南京建成公司），SnoN、TGF-β1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），Collagen I和Collagen IV單克隆抗體（美國Sigma公司），β-actin抗體（中國Boster公司），兩步法免疫組織化學檢測試劑盒、3-氨基-9-乙基卡唑（3-amino-9-ethylcarbozole，AEC）（中杉金橋生物技術有限公司），I抗稀釋液，超敏顯色液（enhanced chemiluminescent，ECL）、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所），Western blot用PVDF膜和3 mm Whatman濾紙（美國Millipore公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

1.1.3主要器材穩(wěn)步倍加型血糖儀（美國強生公司），超低溫冰箱（日本Sanyo公司），高速低溫離心機（美國Beckman公司），Bayer1650全自動生化分析儀（美國Beckman公司），電泳系統(tǒng)及電轉移裝置（瑞典Amersham公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.2　方法

1.2.1動物模型復制及分組SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周后，尾靜脈注射溶于0.01 mol/L（pH=4.5）無菌檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液的STZ（55 mg/kg）復制DM大鼠模型，72 h后測大鼠空腹血糖，血糖≥16.7 mmol/L且尿糖陽性認為復制成功，隨后隨機分成糖尿病組（DM組，n =8）、硫辛酸治療組（ALA 組，n =8）。成模 2周后，采取灌胃方式給予硫辛酸治療，硫辛酸溶于5%的羧甲基纖維素鈉（car-boxy methylated cellulose，CMC）中，灌胃劑量為150 mg/（kg·d），每周給藥6 d，3 d配一次藥（4℃保存）；并設鼠齡相同的正常對照組（NC組，n =8），灌胃同等濃度同等劑量的CMC；6周后處死所有SD大鼠，期間所有大鼠予標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，每周監(jiān)測1次血糖和體重。

1.2.2標本收集大鼠處死前1 d用代謝籠收集24 h尿，記錄尿量，取部分尿液離心后-20℃保存；處死前禁食6～8 h，乙醚麻醉后稱重，股動脈穿刺采血，分離血清-20℃保存；開腹取雙側腎臟，去掉包膜及周圍脂肪組織，稱重記錄腎重/體重（kidney weight/body weight，KW/BW），分別用4%多聚甲醛固定及-80℃保存。

1.2.3生化指標測定葡萄糖氧化酶法測血清葡萄糖（blood glucose，BG），酶分析法檢測血總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（Triglyceride，TG），鄰苯三酚紅比色法測尿蛋白（urine protein，UP），均按試劑盒說明書操作，尿蛋白濃度與尿量乘積為24 h UP。

1.2.4氧化應激水平檢測每個腎組織標本均稱取0.2 g按1∶9的比例與0.9%的生理鹽水混合，置于勻漿器中冰上勻漿組織制成10%的組織勻漿，再用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定組織勻漿的蛋白濃度。最后參照試劑盒說明書進行T-AOC、MDA、CAT和T-SOD的檢測。其中，檢測T-AOC和MDA時直接使用10%的組織勻漿；而檢測CAT時將樣本在10%的組織勻漿的基礎上用生理鹽水作40倍稀釋，檢測T-SOD時將樣本作100倍稀釋。4項指標的檢測均采用比色法。

1.2.5腎組織病理檢查多聚甲醛固定腎組織，制成3μm厚的石蠟切片，行HE及Masson染色，光鏡觀察腎組織形態(tài)結構變化。

1.2.6免疫組織化學染色免疫組織化學染色采用SP兩步法檢測Collagen I在各組大鼠腎組織的分布和表達，石蠟切片脫蠟水化，經3%的過氧化氫去離子水孵育及胰酶修復后，Collagen I（1∶100），4℃孵育過夜加入生物素化二抗，室溫下孵育30 min，AEC顯色，陽性染色為紅色，蘇木素復染，PBS代替一抗，作為陰性對照。

1.2.7Western blot檢測取-80℃保存的各組大鼠腎皮質，每只樣本取200 mg，分別加入組織蛋白提取液后勻漿離心取上清，用BCA試劑盒測定各組蛋白質濃度，按所測得濃度計算每泳道所需體積，加入加樣緩沖液煮沸10 min，經8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入 β-actin、SnoN、TGF-β1、Collagen Ⅳ一抗，工作濃度分別為1∶4 000、1∶300、1∶300、1∶1 000，4℃孵育12～24 h；次日，加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗（濃度均為1∶4 000）室溫孵育1 h，加ECL熒光顯色液，凝膠成像儀曝光，Image Lab軟件分析各條帶調整體積值，每個樣本重復操作3次，以β-actin蛋白條帶作為內參，結果用目標蛋白與β-actin的比值來表示。

1.3　統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數據以均數±標準差（±s）表示，若數據符合正態(tài)分布，通過方差齊性檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1　生化指標檢測結果

大鼠在注射STZ 72 h后，BG升高并持續(xù)在高水平，且尿糖陽性。實驗6周后，3組KW/BW、BG、24 h UP、TC和TG比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），DM組的KW/BW、BG、24 h UP、TC和TG與NC組相比均升高（P ＜0.05）；與DM組相比，ALA組KW/BW、24 h UP、TC和TG均降低（P ＜0.05），而BG增高，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表 1。

2.2　氧化應激水平檢測結果

實驗6周后，3組大鼠腎組織中T-AOC、MDA、T-SOD和CAT比較，采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；DM組T-AOC、T-SOD和CAT與NC組相比降低，使用ALA治療后，ALA組T-AOC、T-SOD和CAT活性較DM組增高（P ＜0.05）；而DM組MDA含量較NC組升高（P ＜0.05），ALA能降低DM大鼠腎組織MDA含量。見表2。

2.3　腎組織病理改變

HE及Masson染色可見正常大鼠腎小管結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊，基底膜完整，間質未見炎癥細胞浸潤；DM組大鼠腎小管腔擴張明顯，腎小管基底膜不規(guī)則增厚，腎小管上皮細胞出現空泡狀改變，間質出現炎癥細胞浸潤，腎小管間質Masson染色陽性物質增多；ALA組大鼠腎臟病變有不同程度的改善，腎小管間質Masson染色陽性物質減少，炎癥細胞浸潤減輕，空泡狀改變不明顯（見圖1、2）。

2.4　免疫組織化學結果

免疫組織化學染色檢測Collagen I的表達，NC組大鼠腎組織Collagen I陽性染色主要存在血管周圍和細胞間質，而DM組大鼠陽性染色增多，可見腎小管基底膜強陽性染色，ALA治療后 Collagen I的表達減少。見圖3。

表1　各組大鼠KW/BW、BG、24 h UP、TC、TG的變化 （n =8，±s）

表1　各組大鼠KW/BW、BG、24 h UP、TC、TG的變化 （n =8，±s）

注：1）與NC組相比，P ＜0.05；2）與DM組相比，P ＜0.05

組別　KW/BW/（mg/g）　BG/（mmol/L）　24 h UP/mg　TC/（mmol/L）　TG/（mmol/L）NC 組　7.28±0.65　5.88±1.05　3.13±0.54　1.41±0.22　1.42±0.38 DM組　12.15±1.571）　25.92±1.861）　20.65±1.051）　2.34±0.301）　2.41±0.591）ALA 組　10.58±0.581）2）　26.60±1.691）　16.12±0.711）2）　1.56±0.332）　1.37±0.452）F值　66.573　119.112　27.566　25.716　13.731 P值　0.000　0.000　0.000　0.000　0.000

表2　各組大鼠氧化應激水平的比較 （n =8，±s）

表2　各組大鼠氧化應激水平的比較 （n =8，±s）

注：1）與NC組相比，P ＜0.05；2）與DM組相比，P ＜0.05

NC 組　0.67±0.02　2.06±0.09　688.53±49.76　44.60±4.50 DM組　0.32±0.011）　2.62±0.091）　433.41±37.111）　24.36±2.491）ALA 組　0.56±0.061）2）　2.19±0.081）2）　640.99±27.522）　44.30±3.572）F值　131.181　72.075　68.405　70.539

2.5　Western blot結果

Western blot檢測各組SnoN、TGF-β1和CollagenⅣ蛋白表達的水平，NC組中，SnoN條帶較粗較強，而TGF-β1和CollagenⅣ條帶較細較弱。與NC組相比，DM組中SnoN條帶灰度值較少，TGF-β1和CollagenⅣ條帶灰度值增加，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）；與DM組相比，ALA組SnoN條帶變粗變強，TGF-β1和Collagen Ⅳ條帶變細變弱，均差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），見圖 4。

圖2　各組大鼠腎組織形態(tài) （Masson染色）

圖3　各組大鼠腎組織Collagen I蛋白表達 （免疫組織化學染色）

圖4　各組大鼠腎組織中SnoN、TGF-β1和Collagen Ⅳ蛋白表達水平比較

3　討論

氧化應激被認為是造成糖尿病及其并發(fā)癥的重要原因之一[6-7]。ROS產生和清除之間的平衡決定了機體內氧化應激水平，ROS產生過多和/或抗氧化系統(tǒng)酶活性的降低可導致體內氧化應激水平增加。OS可以誘導腎臟發(fā)生損傷，主要表現為腎小球和腎小管固有細胞結構和功能上的改變[3]。有研究表明[8-9]，腎臟中過多的OS可以破壞足細胞結構，使腎小球足細胞足突肥大；過多的ROS持續(xù)刺激還將誘導腎小管炎癥反應和腎間質纖維化的形成。本研究復制DM大鼠模型6周后發(fā)現，DM大鼠腎組織脂質過氧化產物MDA含量升高而抗氧化物質T-AOC、T-SOD及CAT活性水平降低，且伴有明顯的腎臟病理學改變，表明糖尿病時其氧化程度加重，抗氧化能力下降。而ALA作為一種抗氧化劑，可與其他抗氧化劑共同作用，抑制脂質過氧化[5，10]。本實驗在DM大鼠模型復制2周后給予ALA治療發(fā)現，ALA組血糖雖然沒有明顯變化，但病理學及生物化學檢查顯示ALA組腎臟病變程度減輕，同時在給予ALA治療后大鼠腎臟脂質過氧化程度減輕，抗氧化能力增強。表明ALA可以降低DM大鼠腎臟的氧化應激水平，改善DM大鼠腎功能和代謝。

有研究表明[11]，在糖尿病或高血糖狀態(tài)下，腎臟內過多的ROS可激活胞內多條信號通路，包括MAPK通路、ERK通路等。還有研究表明[12]，腎小管/間質內過多產生的ROS誘導TGF-β1等致纖維化因子大量釋放和表達，促使腎間質纖維化的發(fā)生。說明腎臟內過多的ROS可能也誘導了TGF-β1信號通路的激活，從而加重其對腎臟的損害。而腎纖維化是DN終末期病理特征之一，有許多細胞因子參與這個過程，TGF-β1是目前公認最重要的致纖維化因子之一，主要通過介導TGF-β1信號通路來發(fā)揮其致纖維化效應[13-14]。SnoN作為TGF-β1信號通路的負調控因子，在腎臟纖維化過程發(fā)揮重要作用，它可以抑制TGF-β1信號通路的激活，并能抑制ECM沉積，從而達到延緩腎纖維化進程的目的[15-16]。本研究提示，DM組SnoN蛋白表達較NC組減少，TGF-β1水平與NC組比增高，并且伴隨著Collagen I、Collagen Ⅳ的大量沉積；而用ALA治療干預后，SnoN蛋白表達增多，TGF-β1蛋白表達和膠原沉積水平均下降。實驗6周后，大鼠腎組織ROS產生增多，脂質過氧化程度加深，抗氧化能力減弱，促進TGF-β1高表達而抑制SnoN蛋白表達，導致SnoN調控TGF-β1信號通路的平衡被破壞，TGF-β1通過其下游胞內信號轉導，促進目的基因Collagen I、Collagen Ⅳ的轉錄和翻譯增多，致使Collagen I、Collagen Ⅳ在腎間質的沉積增多，DN發(fā)生纖維化病變；而用抗氧化劑ALA干預后DM大鼠腎臟脂質過氧化程度減輕，抗氧化能力增強，恢復SnoN蛋白水平并抑制TGF-β1表達，使兩者之間的關系重新得到平衡，進而發(fā)揮延緩和治療DN的作用。

綜上所述，ALA減少了DM大鼠腎臟ROS的產生和脂質損傷，進而上調SnoN蛋白的表達、阻止TGF-β1信號通路的轉導，從而發(fā)揮其延緩或阻斷腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的作用，對DM大鼠腎臟起到保護作用。

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