1型糖尿病大鼠心肌纖維化microRNA表達變化篩選

黃　俊　張明霞　吳均芳　陳云肖　姜　紅

(南昌大學第一附屬醫院心內科，江西　南昌　330006)

心肌纖維化是糖尿病重要并發癥之一，其發病機制并未完全闡明〔1〕。miRNA是近年發現的一類來源于內源性染色體的非編碼單鏈RNA，可對目的基因進行轉錄后表達調控。miRNA在心肌組織有特征性表達，在調控心肌細胞的分化發育，在眾多心臟病變的病理生理過程中起著重要作用〔2，3〕。本文擬建立1型糖尿病大鼠心肌纖維化模型，運用基因芯片技術檢測心肌組織中miRNA差異表達，初步探討miRNA在1型糖尿病心肌纖維化病理過程中的作用。

1　材料與方法

1.1動物、分組、主要試劑和儀器30只雄性SD大鼠，體質量(170±5.85)g；隨機分為糖尿病模型組和對照組各15只。實驗動物按南昌大學醫學院動物倫理委員會規定執行。鏈脲佐菌素(STZ)，TRIzol試劑(Sigma，美國)；血糖儀(強生穩豪血糖儀，美國)；GE VIVI7超聲診斷系統(探頭頻率12 MHz，美國GE)；第六代miRCURY TM LNA Array (v.16.0，Exiqon)；熒光標記、芯片雜交及結果檢測在上海康成生物公司實驗室完成；奧林巴斯BX51顯微鏡。

1.2方法

1.2.1建立糖尿病心肌纖維化大鼠模型參考相關文獻〔4〕，模型組大鼠經單次腹腔注射STZ(60 mg/kg)制作1型糖尿病動物模型。對照組大鼠則單次腹腔注射等量檸檬酸緩沖液。STZ注射后72 h，尾靜脈采血檢測隨機血糖，模型組剔除血糖低于16.7 mmol/L大鼠。成模后每周測量實驗大鼠體質量、血糖1次，血糖高于16.7 mmol/L即認為模型建立成功。

1.2.2心臟功能檢測建模后12 w超聲心動圖檢測，大鼠麻醉固定仰臥略向左傾斜位后獲取胸骨旁左室長軸切面二維及M型超聲圖像，測量左心室射血分數(LVEF)，左室壁厚度(LVWT)，左室舒張末期內徑(LVEDD)，左室收縮末期內徑(LVESD)和左心室短軸縮短率(FS)。

1.2.3心肌VG染色組織學檢查建模后12 w麻醉、處死大鼠，取左心室心肌組織，10%磷酸鹽緩沖液(PBS)中性甲醛固定，脫水、透明、石蠟包埋后制成切片，VG染色觀察心肌組織膠原含量變化，Image-Pro Plus4.0圖像系統測量心肌組織膠原容積分數(CVF，膠原面積/總面積)。

1.2.4心肌組織miRNA表達檢測芯片檢測差異表達miRNA，TRIzol試劑抽提大鼠心肌組織總 RNA，分光光度計定量，甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA質量。分離<100 nt的小分子RNA，miRCURY TM Hy3 TM螢光標記，采用第6代 miRCURY TM LNA Array芯片(包含1 891個成熟miRNA探針，包括miRBase 16.0中所有人類、大鼠和小鼠microRNAs，及與之相關的所有病毒microRNAs，包含66個新的miRPlus TM人類microRNAs探針)進行基因芯片雜交，Axon GenePix 4000B microarray 掃描儀掃描芯片，GenePix Pro 6.0 software軟件對芯片圖像分析。

1.2.5差異miRNA靶基因預測及功能分析采用生物信息學分析方法，運用 miRBase和starBase分析軟件進行差異表達miRNAs的靶標基因預測和功能分析。

1.3統計學方法采用SPSS7.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1兩組生存率、血糖、心臟功能及心肌組織學改變模型組與對照組大鼠生存率分別為93.3%和100.0%；模型組大鼠血糖均>16.7 mmol/L，對照組為5.6～7.4 mmol/L。超聲檢測模型組大鼠LVWT、LVEDD和LVESD明顯大于對照組；LVEF和左心室FS明顯小于對照組(均P<0.05)，見表1。心肌VG染色模型組粉紅色膠原組織增多，對照組黃色心肌組織內僅有少許粉紅色膠原組織表達；膠原半定量分析對照組CVF〔(1.93±0.45)%〕明顯少于模型組〔(8.35±1.02)%,P<0.05〕。

表1　兩組心臟指標比較

與對照組比較：1)P<0.05

2.2miRNA芯片檢測見表2，表3。芯片檢測結果顯示，12 w模型大鼠心肌組織62個miRNAs表達有明顯差異，其中上調miRNAs 38個，下調miRNAs 24個(表達差異標準以上下1.5倍作為域值范圍)，差異倍數改變大于2倍的miRNA共有25個。

表2　模型組上調miRNAs

2.3miRNAs靶基因預測應用生物信息學方法對目前已建立相關數據庫，差異表達≥2倍的miRNA調控的靶基因進行預測，基因主要涉及細胞生長、膠原纖維生長、凋亡、血管生成、細胞分化與增殖等生物學功能，見表4。

表3　模型組下調miRNAs

表4　差異表達miRNAs的主要靶基因及其功能

3　討　論

miRNA為19～22個核苷酸的非編碼小調控RNA，由具有發夾結構的前體RNA經Dicer酶加工生成，通過與mRNA的3′非翻譯區互補序列的堿基配對，指導效應復合物RNA誘導的沉默復合體(RISC)，通過mRNA 降解和翻譯抑制兩種不同機制，調控靶基因表達。miRNA參與包括細胞分裂增殖、分化發育及代謝等許多重要的生物學過程，一種miRNA可能調控多種甚至數百種蛋白質的翻譯過程，多個miRNA也可能作用于同一種mRNA〔2〕。糖尿病患者外周血采用miRNA 芯片技術檢測，發現特異性miRNA表達變化，提示某些miRNA參與了糖尿病的病理生理過程〔4〕。目前有關miRNA 在糖尿病腎病纖維化中的作用研究較多〔5〕，miRNA377在STZ誘導的小鼠糖尿病腎病模型、高糖及轉化生長因子(TGF)-β1共培養的腎系膜細胞中表達均上升，腎系膜細胞過表達miRNA377 能增加纖維連接蛋白等細胞外基質的合成〔6〕。

本文糖尿病大鼠成模12 w后，心臟功能減退、心室擴張，心肌組織內膠原含量增多，心肌纖維化明顯，為1型糖尿病大鼠心肌纖維化心肌組織miRNA表達譜的研究提供了一個可靠的模型，與對照組比較心肌組織差異表達2倍以上的miRNA有25個，其中hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-208a、hsa-miR-150-5p在心臟發育、血管生成及心臟病理過程中有重要調控作用。

miR-29在心臟成纖維細胞中比在心肌細胞中表達得更多，但miR-29在梗死心臟的邊界區表達下調。然而這種對立的調節通過膠原蛋白和彈性蛋白的合成依然與心肌纖維化相關〔3〕。本實驗結果顯示，糖尿病模型大鼠心肌組織miR-29a/b/c表達上調，但對于高糖是否直接通過miR-29影響心肌細胞肥大和心肌纖維化及miR-29所調控的確切靶基因尚需進一步確認。

MiR-208a是目前發現的另一種與心肌肥大和纖維化相關的miRNA。通過轉基因在小鼠心臟中過表達miR-208a可引起心肌肥大。上調miR-208a可能通過顯著抑制靶基因甲狀腺素相關蛋白和肌肉抑制素這兩種肌肉生長和肥大的負性調節者，從而導致心肌肥大、纖維化和心力衰竭〔7〕。本實驗中糖尿病模型大鼠心肌組織miR-208a表達上調，但對于高糖是否直接通過miR-208a影響心肌細胞肥大和心肌纖維化及miR-208a所調控的確切靶基因尚需進一步確認。

循環miR-126減少在非糖尿病人群被發現是一個重要的糖尿病預測因子，從正常葡萄糖耐受，到糖耐量減低，再到糖尿病，miR-126的血漿水平逐漸下降〔8〕。本研究糖尿病模型大鼠心肌組織miR-126表達也顯著下調，但miR-126與糖尿病大鼠心肌纖維化是否有關目前不知。我們前期實驗在STZ制作的1型糖尿病大鼠心肌纖維化模型中，發現心肌微血管內皮細胞同時表達CD31、α-SMA，證實微血管內皮細胞發生間質轉分化，通過該途徑生成大量的成纖維細胞、肌纖維母細胞在心肌纖維化中發揮作用〔9〕。本實驗中miR-328在糖尿病大鼠心肌纖維化中的表達上升4倍。研究發現房顫患者血清miR-328濃度明顯高于正常對照，與房顫持續時間及左心房直徑相關〔10〕。miR-328還可通過靶基因CD44調節小鼠腎小管上皮細胞間質轉分化現象〔11〕。我們推測miR-328有可能調節心肌微血管內皮細胞間質轉分化，在1型糖尿病大鼠心肌纖維化中發揮作用。 本研究利用miRBase和starBase分析軟件，對差異表達的miRNA可能調控的靶基因進行初步預測，這些基因主要涉及細胞生長、膠原纖維生長、凋亡、血管生成、細胞分化與增殖等生物學功能。然而仍有大量預測靶基因及其功能需要實驗加以驗證，且一種miRNA可同時調節多個靶基因表達，一個靶基因又同時受多種miRNA的調控，提示miRNA參與和調控生物學功能的多樣性和復雜性。本研究僅提示miRNAs可能涉及糖尿病心肌纖維化的發生和發展過程，但對于差異表達的miRNAs如何啟動糖尿病心肌纖維化發生機制的問題尚有待深入研究和探討。

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2Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004；116(2)：281-97.

3E van Rooij，Sutherland LB，Thatcher JE，etal.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis〔J〕.PNAS，2008；105(35)：13027-32.

4Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，etal.Plasma microRNA profiling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes〔J〕.Circ Res，2010；107(6)：810-7.

5Kato M，Natarajan R.microRNA cascade in diabetic kidney disease：big impact initiated by a small RNA〔J〕.Cell Cycle，2009；8(22)：3613-4.

6Wang Q，Wang Y，Minto AW，etal.MicroRNA-377 is up-regulated and can lead to increased fibronectin production in diabetic nephropathy〔J〕.FASEB J，2008；22(12)：4126-35.

7Callis TE，Pandya K，Seok HY，etal.MicroRNA208a is a regulator of cardiac hypertrophy and conduction in mice〔J〕.J Clin Invest，2009；119(9)：2772-86.

8Zampetaki A，Kiechl S，Drozdov I，etal.Plasma micro-RNA proling reveals loss of endothelial miR-126 and other microRNAs in type 2 diabetes〔J〕.Circ Res，2010；107(6)：810-7.

9黃俊，張明霞，黃江燕，等.1型糖尿病大鼠心肌微血管內皮細胞間質轉分化的鑒定〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(23)：6653-6.

10McManus DD，Lin H，Tanriverdi K，etal.Relations between circulating microRNAs and atrial fibrillation：data from the Framingham Offspring Study〔J〕.Heart Rhythm，2014；11(4)：663-9.

11Chen CH，Cheng CY，Chen YC，etal.MicroRNA-328 inhibits renal tubular cell epithelial-to-mesenchymal transition by targeting the CD44 in pressure-induced renal fibrosis〔J〕，PLoS One，2014；9(6)：e99802.