早期腸內(nèi)營養(yǎng)對創(chuàng)傷大鼠β-EP、TNF-α、IL-10的表達及免疫功能的影響

熊 睿，汪曉泊，殷生芝，海應(yīng)措，張曉雯，朱 楠，王小明

0 引言

機體創(chuàng)傷后可表現(xiàn)為高代謝的負(fù)氮平衡及全身炎癥反應(yīng)狀態(tài)，使機體遭受嚴(yán)重的損傷[1-2]。過度的炎性反應(yīng)過后可出現(xiàn)過度抗炎反應(yīng)，最終使機體出現(xiàn)免疫力低下，并導(dǎo)致全身感染等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生[3]。積極的腸內(nèi)營養(yǎng)可改善創(chuàng)傷患者的預(yù)后[4]。本研究通過構(gòu)建創(chuàng)傷大鼠模型，于發(fā)病后不同時間點給予腸內(nèi)營養(yǎng)支持，并觀察其對創(chuàng)傷大鼠TNF-α、β-EP、IL-10的表達及免疫功能的影響，為早期腸內(nèi)營養(yǎng)治療提供臨床依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年清潔級Sprague-Dawley大鼠40只，雄性，體重250～400 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，在清潔級環(huán)境下普食飼養(yǎng)，12 h交替光照。

1.2 實驗主要試劑及儀器 ELISA試劑盒(江萊生物科技有限公司)，CD3+、CD4+、CD8+硫氰基熒光素標(biāo)記的單克隆抗體(美國Becton-Dickinson公司)，流式細胞儀器(德國Beckman Dickinson公司)，士強(荷蘭Nutricia公司)，EN輸注泵(荷蘭Nutricia公司)。

1.3 模型構(gòu)建與分組 創(chuàng)傷大鼠模型構(gòu)建：SD大鼠飼養(yǎng)適應(yīng)1周后開始行手術(shù)，術(shù)前禁食12 h，1%氯胺酮麻醉，俯臥后備皮消毒，切開大鼠雙側(cè)后肢髖關(guān)節(jié)周圍皮膚，分離結(jié)扎雙側(cè)股動脈、股靜脈，于髖關(guān)節(jié)處行雙側(cè)股骨離斷術(shù)，縫合創(chuàng)面皮膚。將大鼠仰臥，切開腹部皮膚，在胃部前壁植入帶側(cè)無菌孔硅膠管(外徑1.5 mm)，荷包縫合固定，經(jīng)腹部皮膚隧道孔穿出，固定于大鼠肩胛部皮膚，連接輸液裝置。

分組：40只SD大鼠隨機分為4組，每組10只，A組為正常對照組，大鼠未做手術(shù)。B組為創(chuàng)傷對照組，C組早期腸內(nèi)營養(yǎng)組，術(shù)后當(dāng)日6 h后開始給予腸內(nèi)營養(yǎng)，D組為延遲腸內(nèi)營養(yǎng)組，術(shù)后次日開始給予腸內(nèi)營養(yǎng)。

1.4 營養(yǎng)實施方案 采用士強作為標(biāo)準(zhǔn)腸內(nèi)營養(yǎng)，該營養(yǎng)劑能量為4.18 kJ/mL，喂養(yǎng)前臨時用溫水混勻，將營養(yǎng)液熱量密度控制為6.27 kJ/mL，使大鼠按照總熱量752.4 kJ/(kg·d)計算。創(chuàng)傷后從營養(yǎng)管注入。A組：代謝籠中正常進食，能量與營養(yǎng)液相當(dāng)。B組：代謝籠中正常進食，創(chuàng)傷后6 h開始喂食，能量與營養(yǎng)液相當(dāng)。C組：創(chuàng)傷后6 h開始從營養(yǎng)管灌喂士強營養(yǎng)液，每天2次(10∶00和17∶00)。術(shù)后第1天給予標(biāo)準(zhǔn)熱量的1/3，第2天給予標(biāo)準(zhǔn)熱量的1/2，從第3天起給予全量，連續(xù)喂養(yǎng)7 d。D組：創(chuàng)傷第2天開始灌喂士強營養(yǎng)液，給予標(biāo)準(zhǔn)熱量的1/3，第3天給予標(biāo)準(zhǔn)熱量的1/2，第4天起給予全量，連續(xù)喂養(yǎng)7 d。

1.5 檢測方法和指標(biāo) 于實驗前1 d及實驗結(jié)束時，在無菌條件下采集血標(biāo)本。用流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+水平；使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測β-EP、TNF-α、IL-10水平，嚴(yán)格按試劑說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 早期腸內(nèi)營養(yǎng)對創(chuàng)傷后大鼠淋巴細胞亞群的影響 結(jié)果顯示，四組CD8+細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；B組術(shù)后CD4+細胞數(shù)量與CD4+/CD8+比值顯著低于A組(P<0.05)；C組和D組CD4+與CD4+/CD8+比值相對于A組均有下降(P<0.05)，但均高于B組(P<0.05)；C組CD4+與CD4+/CD8+比值顯著高于D組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠T細胞表型含量變化

注：*與A組比較，P<0.05(*1t=-5.181，*2t=-3.219，*3t=-1.841,*4t=-2.219，*5t=-4.325,*6t=-2.267)；#與D組比較，P<0.05(#1t=2.985,#2t=1.837)

2.2 早期腸內(nèi)營養(yǎng)對創(chuàng)傷后大鼠炎性細胞因子的影響 結(jié)果顯示，與A組比較，B組β-EP、TNF-α、IL-10均顯著升高(P<0.05)。與B組比較，C組和D組β-EP、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，IL-10顯著升高(P<0.05)。與D組比較，C組β-EP、TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)，IL-10顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組術(shù)后β-EP、TNF-α、IL-10水平比較

注：*與A組比較，P<0.05(*1t=18.010，*2t=21.537，*3t=16.327，*4t=-16781，*5t=-12.346，*6t=9.846，*7t=-12.343，*8t=-11.325，*9t=9.584；*與D組比較，P<0.05(#1t=-11.232，#2t=-9.346，#3t=11.034)

3 討論

創(chuàng)傷是各種機械因素對人體組織或器官的損壞，創(chuàng)傷后可使機體出現(xiàn)代謝和免疫功能紊亂[5]。炎癥反應(yīng)是創(chuàng)傷后機體早期變化之一，嚴(yán)重的創(chuàng)傷后過強的炎癥反應(yīng)是機體損傷的重要機制，主要表現(xiàn)為全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)，機體呈高分解代謝狀態(tài)，以及多器官功能衰竭(MODS)、休克、膿毒癥等創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)生[6-7]。深入研究創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)機制，可為創(chuàng)傷后全身性損害及并發(fā)癥的防治提供新的思路和方法。

本研究選取的β-EP、TNF-α、IL-10分別是創(chuàng)傷炎癥反應(yīng)過程中具有代表性的生物活性調(diào)節(jié)因子、促炎及抗炎細胞因子，可對創(chuàng)傷后炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展進行綜合而有效的評估。其中β-EP屬于內(nèi)源性阿片肽，由腦下垂體和丘腦下部所分泌的一種氨基化合物，生理情況下其與機體的鎮(zhèn)痛、情緒、應(yīng)激、免疫功能、胃腸道活動的調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)的抑制等有關(guān)，在神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮雙向聯(lián)系的作用[8-9]。Maddila等[10]研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后大鼠血漿β-EP水平的升高及恢復(fù)的時間與創(chuàng)傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)。研究顯示，β-EP可增強兔腦出血模型單核細胞IL-1、IL-2、IL-8的表達，且表現(xiàn)出了與免疫功能變化一致的趨勢[11]。TNF-α是一種炎癥反應(yīng)啟動因子，由活化的單核/巨噬細胞產(chǎn)生，是一種引起組織損傷的重要促炎因子[12-13]。IL-10是目前發(fā)現(xiàn)的一種強效抗炎細胞因子，主要由Th2細胞產(chǎn)生，主要生理功能是抑制TNF-α、IL-6、IL-8等多種炎性細胞因子的活性，抑制集落刺激因子的合成，減輕機體炎癥反應(yīng)[14-15]。筆者對β-EP、TNF-α、IL-10進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后大鼠β-EP、TNF-α、IL-10水平均顯著高于正常對照組，提示β-EP、TNF-α、IL-10均參與了創(chuàng)傷后炎癥反應(yīng)過程。

創(chuàng)傷后的機體往往伴隨嚴(yán)重的免疫功能紊亂，且免疫抑制程度與SIRS和創(chuàng)傷的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Hua等[16]研究發(fā)現(xiàn)，重度顱腦損傷的大鼠72 h內(nèi)可迅速發(fā)生免疫功能抑制，Th細胞(CD4+)、自然殺傷細胞(NK)顯著減少，Th細胞與Ts細胞(CD4+/CD8+)比值降低，淋巴因子激活殺傷細胞活力下降。本研究顯示，與正常對照組大鼠比較，創(chuàng)傷對照組大鼠CD4+細胞數(shù)量與CD4+/CD8+比值顯著降低。提示創(chuàng)傷后大鼠確實存在免疫功能紊亂，與鄧秋林等[17]的研究一致。

腸道是體內(nèi)最大的免疫器官，創(chuàng)傷可導(dǎo)致腸道黏膜屏障損傷，腸黏膜細胞能量代謝障礙，腸蠕動減弱或停滯，腸黏膜黏液分泌較少，細菌移位[18]。本研究結(jié)果提示，經(jīng)腸內(nèi)營養(yǎng)治療后，早期腸內(nèi)營養(yǎng)組和晚期腸內(nèi)營養(yǎng)組β-EP、TNF-α水平均顯著降低，IL-10顯著升高，CD4+與CD4+/CD8+比值均得到改善。表明腸內(nèi)營養(yǎng)通過有效調(diào)節(jié)機體促炎和抗炎反應(yīng)，減輕過度炎癥反應(yīng)對機體的損傷，同時提示腸內(nèi)營養(yǎng)是一種改善機體免疫狀態(tài)、控制感染的最簡單有效的方法。這可能與士強中含有谷氨酰胺、精氨酸、ω-3不飽和脂肪酸等物質(zhì)有關(guān)。谷氨酰胺可促進淋巴細胞的分化和增殖，調(diào)節(jié)機體的免疫應(yīng)答、抗原識別和提呈，以及各類細胞因子的合成。精氨酸可刺激淋巴細胞的增殖，促進一氧化氮的合成，并可調(diào)節(jié)巨噬細胞和淋巴細胞分泌細胞因子。ω-3不飽和脂肪酸可增強細胞膜的穩(wěn)定性，影響受體和配體的形成和結(jié)合、細胞運動等調(diào)節(jié)細胞因子的生成和釋放，同時還可以通過降低PGE2、TXA2等花生四烯酸衍生物的合成來減輕機體炎性反應(yīng)[19-20]。而早期腸內(nèi)營養(yǎng)比晚期腸內(nèi)營養(yǎng)更能改善機體的免疫功能，減輕機體免疫反應(yīng)，這與早期腸內(nèi)營養(yǎng)對腸道神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂的調(diào)節(jié)，早期腸黏膜有效的刺激，腸道血液灌流的改善和腸黏膜細胞能量代謝的增強有關(guān)。當(dāng)然也有不贊成早期腸內(nèi)營養(yǎng)的觀點，主要擔(dān)心創(chuàng)傷早期腸道水腫、充血嚴(yán)重，運動和吸收功能較差，早期腸內(nèi)營養(yǎng)會增加胃腸道負(fù)擔(dān)，不利于疾病的康復(fù)。筆者認(rèn)為，早期腸內(nèi)營養(yǎng)應(yīng)該循序漸進，本實驗中首日給予標(biāo)準(zhǔn)劑量的1/3，次日給予1/2，第3日才給予全量。早期腸內(nèi)營養(yǎng)的目的是在及時補充各類能量物質(zhì)的同時，盡早給予胃腸道適宜的有效刺激，改善神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，調(diào)節(jié)腸道功能。

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