虎杖對COPD模型大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達的干預研究

石亞莉 樓黎明 陳素珍 王世強 胡丹丹 黃冉冉 徐一凱

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo- nary disease，COPD）是一種以氣流受限和呼吸系統癥狀持續存在為特征的常見疾病[1]。但目前為止COPD發病機制仍未完全明確，較肯定的包括蛋白酶/抗蛋白酶和氧化/抗氧化失衡、氣道和肺實質慢性炎癥等[2]，其中基質金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）、基質金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）及其比值的研究較為廣泛。已有實驗研究證明虎杖提取物白藜蘆醇對COPD模型大鼠肺組織發揮抗炎、抗氧化作用，對肺組織具有保護作用[3]。本研究采用熏煙和氣管內滴入脂多糖（LPS）的方法創建大鼠COPD模型，以觀察虎杖對COPD大鼠模型肺組織MMP-9和TIMP-1表達的影響，進一步探索其可能作用機制。

1 實驗材料

1.1動 物 健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體質量240～257g，周齡4周左右，來源于上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016,由浙江中醫藥大學動物實驗中心飼養（溫度23～25℃，濕度約 70%）。

1.2藥物與試劑 虎杖煎劑：杭州華東中藥飲片有限公司生產，批號161020，由浙江省中山醫院中藥房煎至成1mg/mL備用。強的松：規格5mg/片，浙江仙琚制藥股份有限公司生產，批號160693。脂多糖：規格 10mg/支，美國 Sigma公司，批號 L-2880。RNAiso Plus試劑盒（日本 Takara公司，批號 9109）；Prime－Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒（日本Takara公司，批號RR047A）；SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（日本 Takara公司，批號 RR820A）。

2 實驗方法

2.1分組及模型制備 雄性SD大鼠40只隨機分成正常對照組、COPD模型組、強的松組、虎杖組，每組10只。除正常對照組外，COPD模型組、強的松組、虎杖組采用煙熏+氣管內注入脂多糖方法建立大鼠COPD模型[4]。將大鼠放入定制的有機玻璃煙熏箱內被動吸煙，1次20支香煙，持續1h，1天2次，每次熏煙間隔4h，熏煙8周。在煙熏的第1、14、28天用10%水合氯醛（10mL/kg）麻醉大鼠，經氣管滴入LPS的生理鹽水溶液（200μL）。

2.2給藥方法 正常對照組、COPD模型組予6mL/kg生理鹽水灌胃，強的松組予強的松6mg/kg灌胃，虎杖組予虎杖煎劑6g/kg灌胃，在熏煙的第29天開始藥物干預，每天熏煙前30min給予大鼠灌胃，給藥28天。

2.3標本采集 在給藥第28天，大鼠予水合氯醛腹腔注射麻醉，經腹主動脈采血處死。取左肺組織固定于福爾馬林中備用；右肺組織經液氮速凍后，于-80攝氏度冰箱保存，待用RT-PCR檢測。

2.4肺組織病理改變 左肺組織用梯度酒精脫水、浸蠟和包埋，制成石蠟塊，用蘇木素染色，鹽酸酒精分化及自來水返藍，之后伊紅染色，再次脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察炎癥細胞浸潤，光學顯微鏡下進行肺組織病理觀察。

2.5Real-Time PCR法檢測肺組織MMP-9、TIMP-1 mRNA表達水平 從液氮速凍右肺組織中提取細胞，按照RNAiso Plus Total RNA Reagent試劑盒步驟進行RNA的提取、洗滌、溶解，RNA濃度測定，再按照PrimeScript RT regent Kit With gDNA Eraser反轉錄試劑盒步驟進行cDNA的合成。最后將樣品cDNA 稀釋 5～20倍，選取內參基因（GAPDH）。采用SYBR試劑法，對所得的樣品進行表達分析。放入LightCycler 480 Real-time PCR儀中進行擴增。熒光定量 PCR 反應程序：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40個循環；95℃，5s，60℃，1min，用于檢測溶解曲線。采用2-△△CT法分析樣品間的相對表達量。使用Primer5.0軟件，分別設計目標基因和內參基因的QPCR引物（表1），引物由杭州華安生物技術有限公司合成。

2.6統計學方法 所有數據應用SPSS17.0統計軟件進行數據處理，計量資料用均數±標準差（x±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1各組大鼠肺組織超微結構變化 對照組大鼠肺組織氣道結構基本正常，上皮細胞完整，氣道周圍和血管周圍組織未見炎癥細胞浸潤；肺泡形態正常，肺泡間隔未增厚；與正常對照組相比，COPD三組大鼠，肺組織大量上皮細胞脫落，黏膜上皮增生，炎性細胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡縮小，甚至出現肺泡實變。強的松組、虎杖干預組肺組織損傷輕于COPD模型組，見圖 1（封底）。

表1 目標基因引物序列及產物長度

3.2各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1 mRNA表達比較 與正常對照組比較，其余三組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1 mRNA表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與COPD模型組比較，強的松組、虎杖組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1 mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05），見表 2。

表2 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1 mRNA相對表達量比較（x±s）

4 討論

慢阻肺病理改變表現為氣道、肺實質和肺血管的慢性炎癥，炎癥反應導致實質破壞、黏液高分泌，增加細支氣管周圍和間質纖維化，促進小氣道氣流受限的發生，而持續氣流受限的重要因素之一為氣道重塑[5]。誘發氣道重塑的原因之一是細胞外基質（ECM）的異常降解和沉積，在ECM降解過程中，蛋白酶主要通過降解基質中的彈性蛋白，破壞彈性蛋白保持小氣道通暢和肺泡壁彈性的作用，引起氣道及實質的破壞，這種破壞是COPD肺氣腫特征的重要成因[6]。此后新合成的彈性蛋白，不能完全形成鏈即ECM，發揮結構支撐的作用，這也可能是氣道重塑的機理之一。

基質金屬蛋白酶（MMPs）家族在已知的二十多個成員中MMP-9是最主要的彈性蛋白水解酶[7]。MMP-9主要來源于肺泡巨噬細胞、中性粒細胞，降解氣道、肺泡基底膜及ECM中彈性蛋白，促進液體滲出、炎癥介質釋放，加劇黏液分泌和氣道炎癥反應[8]；彈性蛋白的降解，進而導致COPD肺泡基質及肺泡結構破壞，從而MMP-9參與氣道重塑，導致持續性氣流受限和炎癥反應。TIMP-1是一種能特異性抑制MMP-9活性的金屬蛋白酶組織抑制劑。TIMP-1通過抑制MMP-9的活性減少ECM的降解破壞，并能使肺泡ECM沉積，反映氣道纖維化和修復重塑的過程[9]。MMP-9/TIMP-1的平衡是維持ECM正常狀態所必須的，一旦平衡打破則出現病理狀態。MMP-9、TIMP-1及其比值的平衡是維持基質正常狀態所必須的。MMP-9、TIMP-1的表達及其比值升高，表明處于以炎癥反應為主的病理狀態，以組織破壞為主；表達及比值下降，氣道表面以修復為主[10]。

慢阻肺歸屬中醫“肺脹、喘證、咳嗽”，病位在肺、脾、腎三臟，病理因素主要為痰、瘀、虛三者。急性發作期的病機主要為痰熱夾瘀，治則以祛痰化瘀，宣肺泄熱為主[11]?；⒄仁家娪凇独坠谥苏摗罚湫晕段⒑⒖啵瑲w肝、膽、肺經，其主要功能有利濕退黃，散瘀止痛，清熱解毒，止咳化痰等?；钚猿煞种饕写簏S素、大黃素甲醚、虎杖苷和白藜蘆醇[12]。研究[12-13]證實白藜蘆醇抑制香煙煙霧（CSM）介導COPD中肺泡巨噬細胞的炎癥細胞因子釋放，通過減少促炎細胞因子的釋放，提高谷胱甘肽的含量，降低肺組織的髓過氧化物酶（MPO）活性，從而減少肺損傷。白藜蘆醇亦可通過核轉錄因子（NF-κB）通路顯著抑制基質金屬蛋白酶的表達[14]，調節蛋白酶/抗蛋白酶平衡。慢阻肺急性加重期中醫辨證分型，痰熱瘀阻型約占47.3%[15]，組方多配伍虎杖歸肺經以活血清熱、化痰止咳[16]。

本實驗發現，虎杖組、強的松組大鼠肺組織切片較COPD模型組結構較完整，此結果與虎杖及糖皮質激素對COPD肺組織具有保護作用的眾多研究相符。與正常對照組比較，COPD三組大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1mRNA表達水平均明顯升高（P＜0.05），這與 Higashimoto 等[17]的研究相符，提示MMP-9和TIMP-1參與慢阻肺氣流受限及氣道重塑的發生發展；經強的松、虎杖干預后，大鼠肺組織MMP-9和TIMP-1mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05），證明二者均具有抗炎作用。提示虎杖用于COPD大鼠可顯著改善MMP-9/TIMP-1失調，可抑制炎癥反應、氣道重塑，可保護肺組織、改善氣流受限。但虎杖組干預作用不及強的松組（P＜0.05）。

綜上所述，模型組COPD大鼠存在蛋白酶/抗蛋白酶的失衡狀態，經虎杖煎劑干預后可改善肺組織MMP-9和TIMP-1mRNA表達水平及其失衡，有利于抑制其炎癥反應，保護肺泡基質延緩氣道重塑，但目前其機制尚未確定，有待進一步研究[本文受浙江中醫藥大學附屬第三醫院院級醫藥衛生科技計劃（No.ZS16ZA01）、浙江中醫藥大學校級科研基金（No.2013ZR03）資助]。

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