川楝素對順鉑抗肺癌活性的影響及其機制研究

葉海南

非小細胞肺癌是我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。在肺癌的治療中，以順鉑為代表的化療是一線化療方案。然而順鉑的長期大劑量使用會造成患者較大的副反應，且肺癌細胞對順鉑的敏感性會隨著順鉑的長期應用而下降[2-3]。因此通過輔助治療藥物提高肺癌細胞對順鉑的敏感性是提高其療效的有效方法。本研究的目的在于研究天然藥物活性成分川楝素對順鉑抗肺癌活性的協同效應并研究其機制。

1 材料與方法

1.1材 料 川楝素（批號58812-37-6）購于南京春秋生物工程有限公司。順鉑（批號P4394）、噻唑藍（MTT，批號 M2128）和凋亡檢測試劑盒（批號APOAF）購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養基（批號11995065）購于美國Gibco。X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）、半胱天冬酶-3（Caspase-3）和 β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號#14334、#9502、#9662、#4970）購于美國 Cell Signaling。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠（批號SC-2002）購于美國Santa Cruz。增強化學發光（ECL）試劑盒（批號 32196）購于美國 Pierce。脂質體 2000（Lipofectamine 2000）（批號 11668019）和 pcDNA3.1（批號V79520）購于美國 Invitrogen。

1.2細胞培養 人非小細胞肺癌細胞系A549購于美國ATCC（美國模式菌種收集中心）。細胞培養在含10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養環境為37°C恒溫培養箱中培養并通入5%CO2。細胞每2～3天傳代一次，傳代時，用胰酶消化液使細胞進入懸浮狀態并用DMEM培養基洗滌兩次，將細胞懸液按1:3稀釋后傳代。

1.3XIAP重組質粒構建和轉染 將XIAP基因的開放閱讀框架序列經PCR擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構建成XIAP重組過表達質粒。A549細胞接種在6孔板中孵育過夜使之貼壁。將空質粒或XIAP質粒（終濃度為2μg/mL）用Lipofectamine2000進行包裹后將其加入到無血清培養基進行混合。將貼壁的A549細胞置于該無血清培養基孵育6h，之后棄去無血清培養基加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養24h。收集細胞用于后續實驗。

1.4細胞活力抑制率測定 將A549細胞按5×103/孔接種在96孔板中，分為對照組、川楝素組、順鉑組、川楝素+順鉑組及川楝素+順鉑+XIAP質粒組。對照組為轉染空質粒的A549不加藥物處理48h，川楝素組為轉染空質粒的A549加入10μmol/L川楝素處理48h，順鉑組為轉染空質粒的A549加入2μmol/L順鉑處理48h，川楝素+順鉑組為轉染空質粒的A549加入2μmol/L順鉑和10μmol/L川楝素處理48h，川楝素+順鉑+XIAP質粒組為轉染XIAP質粒的A549加入2μmol/L順鉑和10μmol/L川楝素處理48h。藥物處理完畢后加入 20μL MTT（5mg/mL）37°C 恒溫培養箱中培養4h，移除孔內培養基，加入100μL二甲亞砜，570nm波長下測定OD值。細胞活力抑制率計算公式：細胞活力抑制率=（OD對照組-OD藥物處理組）/OD對照組×100%。

1.5免疫共沉淀 將A549細胞按上述分組處理后進行細胞計數，取2×106個的各組細胞用蛋白提取液提取其中的總蛋白質。總蛋白質分成等量兩份，一份在蛋白提取液中加入XIAP抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。孵育完成后離心收集管底的瓊脂糖珠。瓊脂糖珠加入Western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5min使蛋白質與糖珠分離，用于進行Western blot實驗。另一份用作免疫共沉淀實驗的對照（Input）直接進行Sestern blot實驗，檢測Caspase-9和Caspase-3的總量。

1.6Western blot實驗 將A549細胞按上述分組處理后進行細胞計數，取2×106個的各組細胞用蛋白提取液提取其中的總蛋白質。將上述總蛋白質用12%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上，用XIAP、Caspase-9、Caspase-3 和 β-actin 抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

1.7細胞凋亡實驗 將A549細胞按上述分組處理后按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶（PI）和Annexin-V加入細胞中孵育20min，采用流式細胞術檢測腫瘤細胞的凋亡，Annexin-V陽性細胞為凋亡細胞。

1.8統計學方法 所有實驗重復3次，實驗數據用（x±s） 表示并用SPSS14.0統計分析軟件進行處理，兩組間均數比較采用Student’s t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結果

2.1川楝素顯著增強A549細胞對順鉑的敏感性MTT實驗結果顯示川楝素+順鉑組A549的細胞活力抑制率顯著高于順鉑單處理組和川楝素單處理組（P＜0.05）。流式細胞實驗結果顯示川楝素+順鉑組A549的細胞凋亡率顯著高于順鉑單處理組和川楝素單處理組，見表1。這些實驗結果表明川楝素顯著增強A549細胞對順鉑的敏感性。

2.2川楝素通過下調XIAP的表達抑制A549細胞中XIAP與Caspase-9和Caspase-3的相互作用 Western blot實驗結果顯示，川楝素處理能顯著降低A549細胞中XIAP的表達水平（圖1）。免疫共沉淀實驗結果顯示各組A549細胞中Caspase-9和Caspase-3的總蛋白量（Input）無差別，但川楝素處理能顯著抑制XIAP與Caspase-9和Caspase-3的結合（圖2）。這些結果表明川楝素能通過下調XIAP的表達抑制A549細胞中XIAP與Caspase-9和Caspase-3的相互作用。

表1 川楝素對順鉑抗肺癌活性的干預作用（%，x±s）

圖1 川楝素對XIAP表達的干預作用

圖2 川楝素抑制XIAP與Caspase-9和Caspase-3的相互作用

2.3川楝素通過抑制A549細胞中XIAP的表達增強順鉑的凋亡誘導活性 Western blot實驗結果顯示川楝素能顯著增強順鉑對A549細胞Caspase-9和Caspase-3的活化，但轉染XIAP質粒能顯著抑制兩者聯合對A549細胞Caspases的活化（圖3）。這表明川楝素通過抑制A549細胞中XIAP的表達增強順鉑的凋亡誘導活性。

3 討論

川楝素是中藥川楝子的主要活性成分，具有很強的藥理學活性。近年研究發現川楝素還具有一定的抗腫瘤作用，對多種惡性腫瘤均有良好的輔助治療作用[4-6]。本研究顯示，川楝素能顯著增強順鉑對肺癌細胞的殺傷活性和凋亡誘導活性，表明川楝素與順鉑存在協同效應，能提高順鉑的抗肺癌活性。

XIAP屬于抗凋亡蛋白家族成員，它能與Caspases結合，從而阻止Caspases的活化，抑制凋亡的發生[7]。研究表明，腫瘤細胞中XIAP的過度表達能引起腫瘤細胞對化療藥物的抵抗，從而影響癌癥患者的預后。因此XIAP目前已成為腫瘤治療的一個靶點[8-10]。本研究發現，川楝素能顯著下調肺癌細胞中XIAP的蛋白表達，進而抑制XIAP與Caspase-9和Caspase-3的相互作用。因此將肺癌細胞用川楝素處理后，細胞中游離Caspase-9和Caspase-3的水平顯著增加，更多的Caspase-9和Caspase-3能在凋亡信號的作用下發生活化，最終導致肺癌細胞發生凋亡。當用XIAP表達質粒上調肺癌細胞中XIAP的表達后，川楝素對順鉑的協同效應受到明顯抑制，證明川楝素是通過下調肺癌細胞中XIAP的蛋白表達增強順鉑介導的Caspase-9和Caspase-3的活化，導致細胞發生凋亡性死亡。

綜上所述，川楝素能顯著提高肺癌細胞對順鉑的敏感性，增強順鉑的抗腫瘤活性。這些研究為提高順鉑的療效降低其使用劑量提供了新的策略和思路。

圖3 川楝素對A549細胞Caspase-9和Caspase-3活化的干預作用

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