急性缺血性腦卒中患者血清閉鎖蛋白1、4的動態變化及其與腸黏膜屏障功能的關系

王建兒 賀蘭花 林偉華 鄭元秀 汪鐵軍

急性缺血性腦卒中發病急、變化快、致死致殘率高，占全部腦卒中的60～80%，是腦卒中最常見的類型[1]，嚴重危害人類健康。作為重要的應激源，近年來，急性缺血性腦卒中誘發的腸道黏膜屏障功能障礙（intestinal barrier functional disturbance，IBFD）受到了越來越多的關注[2-4]。IBFD可引起腸道細菌及內毒素易位，導致腸源性感染的發生，誘發或加重多器官功能障礙，嚴重影響缺血性腦卒中預后。閉鎖蛋白1（claudin1）和閉鎖蛋白 4（claudin4）是反應腸道黏膜緊密連接的重要指標，在維持上皮細胞極性和調節腸屏障的通透性等方面起重要作用[5]。本研究旨在觀察急性缺血性腦卒中患者血清claudin-1、claudin-4的變化，以期為急性缺血性腦卒中IBFD的防治與預后提供理論和實驗依據。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2015年3月—2016年2月杭州市余杭區第二人民醫院神經內科住院的急性缺血性腦卒中患者78例為觀察組，男44例，女34例，平均年齡（68.45±9.82）歲。對照組40名選自我院健康體檢者，男 23名，女 17名，平均年齡（65.23±10.39）歲，均無腦血管病史、無創傷手術等應激源及腸道疾病病史。兩組患者性別構成比及年齡差異均無統計學意義（P＞0.05）。

1.2急性缺血性腦卒中患者納入與排除標準 納入標準：（1）符合2014年中華醫學會神經病學分會制訂的《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》中急性缺血性腦卒中診斷標準[1]：急性起病；局灶性神經功能缺損，少數為全面神經功能缺損；癥狀和體征持續數小時以上；頭顱CT或MRI排除腦出血和其他病變；腦CT或MRI有責任梗死病灶。（2）年齡50～80歲。（3）患者家屬簽署知情同意書。（4）急性缺血性腦卒中為首次發作者。（5）發病24h內就診，住院時間＞14d。排除標準：（1）嚴重心肝腎等臟器功能衰竭患者；（2）原有腸道疾病患者；（3）存在其他嚴重創傷、手術、精神疾病等應激源；（4）既往有精神疾病患者；（5）正在接受放化療的腫瘤患者。

2 方 法

2.1血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、內毒素（endotoxin，ET）、claudin-1及claudin-4含量測定

所有患者分別于發病24h、3d、7d及14d四個時間點空腹采靜脈血10mL（對照組于入組當日清晨空腹采取靜脈血 10mL）置于室溫下放置 1h后，4℃2000r/min離心7min，取上清液置-70℃冰箱保存。采用酶聯免疫吸附試驗法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）、內毒素（endotoxin，ET）、claudin-1 及claudin-4含量。DAO ELISA試劑盒由上海信裕生物科技有限公司提供（批號XY-E10955），ET ELISA試劑盒由上海豐壽實業有限公司提供（批號fs-（a）-1686），claudin-1（批號 187362）及 claudin-4（批號187341）ELISA試劑盒均由ZYMED公司提供。使用美國biotek寶特ELX50型酶標儀進行檢測。

2.2統計學方法 應用SPSS11.5軟件，計量資料以（x±s） 表示，經方差齊性檢驗后兩組比較采用配對t檢驗。組間各時間點比較采用重復測量資料的方差分析（ANOVA），相關性及回歸分析采用Spearman及線性回歸進行分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1兩組研究對象血清DAO、ET含量比較 與對照組比較，觀察組發病24h時血清DAO、ET含量均顯著升高（P＜0.01），隨后的 3d、7d 及 14d，觀察組血清DAO、ET含量均持續高水平表達，在14d時，觀察組血清DAO、ET含量呈下降趨勢，但仍明顯高于對照組及發病 24h 時（P＜0.05，P＜0.01），見表 1。

3.2兩組研究對象血清claudin-1及claudin-4含量比較 與對照組比較，觀察組24h時血清claudin-1含量顯著下降（P＜0.01），而血清claudin-4含量則明顯上升（P＜0.01）。隨著時間的延長，觀察組血清claudin-1含量呈上升趨勢，而血清claudin-4含量則出現下降趨勢。至14d時，觀察組血清claudin-1含量仍明顯低于對照組，但較發病24小時有所升高（P＜0.05）；而血清claudin-4含量仍明顯高于對照組，但較發病24h時有所降低（P＜0.05），見表2。

表1 兩組研究對象血清DAO、ET含量比較（x±s）

表2 兩組研究對象血清claudin-1及claudin-4含量比較（pg/mL，x±s）

3.3相關及回歸分析 claudin-1含量與血清DAO、ET 含量呈明顯負相關（r=-0.678、-0.724，P＜0.01）；claudin-4含量與血清DAO、ET含量呈明顯正相關（r=0.634、0.828，P＜0.01）。

4 討論

缺血性腦卒中作為急性應激源所引起的消化道癥狀臨床中十分常見[6]，其誘發的IBFD亦受到了越來越多的關注[2-4]。腸道作為應激反應的中心器官[7]，當機體出現急性應激反應時，交感-腎上腺髓質系統強烈興奮，腸道血管收縮，血流量減少，使腸黏膜組織供氧減少，腸道通透性增加，從而導致原先正常寄生于腸道內的微生物及其毒素發生移位，越過腸黏膜屏障大量侵入腸道以外的組織，如腸壁漿膜、腸系膜淋巴結、門靜脈以及其他遠處器官，引發腸源性的全身感染，甚至導致多器官功能障礙綜合征。因此防治IBFD對于改善缺血性腦卒中的預后具有重要意義。

目前，臨床上常通過測定外周血血清ET及DAO水平反應腸道黏膜屏障功能指標[8]。ET是G-細菌細胞壁的脂多糖成分，細菌死亡溶解時釋放入血，IBFD時會向腸腔外遷移，引起發熱、微循環障礙等內毒素休克癥狀，監測外周血中的ET水平，是了解腸通透性的重要手段。DAO存在于小腸黏膜絨毛上層內的高度活性的細胞內酶，當腸道黏膜細胞受損時釋放入血，或隨壞死脫落的腸黏膜細胞進入腸腔。由于DAO在外周血中活性穩定，因此測定外周血DAO水平能較早體現腸黏膜的完整性和損傷程度[9]。本研究發現，與對照組比較，觀察組發病24h時血清DAO、ET含量均顯著升高（P＜0.01），提示急性腦卒中患者較早出現了IBFD，導致腸源性內毒素血癥的發生。

腸道黏膜上皮細胞緊密連接對維持腸上皮機械結構完整和正常功能有重要作用[10]。緊密連接由claudins、咬合蛋白（occludin）和連接黏附分子（junction adhesion moleucule，JAMs）3 種膜蛋白及閉合小環蛋白（ZO-1、ZO-2和 ZO-3）組成。其中 claudins功能最為重要，是構成緊密連接的主要骨架蛋白。Claudin-1和Claudin-4是claudins家族的主要成員之一，分子量在22～27kDa之間，有4個疏水跨膜區、兩個細胞外環形結構和位于胞質中的羧基端、氨基端。Claudin-1、Claudin-4的異常表達可引起IBFD，導致緊密連接功能失調和組織滲透性的增加，是包括腸易激綜合征、炎癥性腸病等多種疾病的共同病理學基礎。Claudin-1表達升高使腸黏膜緊密連接通透性下降，水和電解質滲出困難，形成便秘；而Claudin-4表達降低則可使其通透性增強，水和電解質滲出增多，形成腹瀉[5]。本研究發現，觀察組發病24h時血清claudin-1含量較對照組顯著下降（P＜0.01），而血清 claudin-4 含量則明顯上升（P＜0.01），可能由此導致腸黏膜通透性增加，造成腸黏膜屏障功能損傷。此外，本研究通過動態觀察指標變化，發現患者血清ET 24h、DAO 3d達到高峰水平，隨后呈緩慢下降趨勢，血清claudin-4含量出現了與血清DAO、ET同向的變化趨勢。血清claudin-1含量在24h時達最低值且明顯低于其他時間點，隨著時間的延長，在3、7、14d呈明顯上升趨勢。分析可能的原因是急性缺血腦卒中引起腸道早期的缺血低氧可能是早期腸黏膜通透性改變的主要原因，而隨后腸道的代償機制和修復反應一定程度上減輕了這些損傷[10]。相關性分析表明，claudin-1含量與血清DAO、ET含量呈明顯負相關，claudin-4含量與血清DAO、ET含量呈明顯正相關，提示由claudin-1、claudin-4蛋白組成的緊密連接的破壞與腸黏膜損傷密切相關，是IBFD的重要分子機制。

綜上所述，急性缺血性腦卒中時，患者存在明顯的IBFD，腸黏膜緊密連接蛋白claudin-1、claudin-4表達異常導致緊密連接結構破壞可能是發生IBFD的重要機制。

［1］中華醫學會神經病學分會.中國急性缺血性腦卒中診治指南 2014［J］.中華神經科雜志，2015，48（4）：246-257.

［2］史福平，王惠凌，邸衛英.不同部位重型腦梗死患者腸黏膜屏障功能變化研究［J］.腦與神經疾病雜志，2014，22（3）：177-179.

［3］史冬梅，張銳，杜秀民.加味大承氣湯灌腸保護腦卒中患者腸黏膜研究［J］.中華全科醫學，2009，7（12）：1294-1295.

［4］劉海燕，王惠凌，姜源濤，等.大面積腦梗死患者發病早期腸黏膜屏障功能及全身炎癥反應變化研究［J］.實用心腦肺血管病雜志，2015，23（ 2）：28-30.

［5］馬軍宏，于向陽，張楠，等.緊密連接蛋白與腸黏膜屏障損傷研究進展［J］.中國中西醫結合外科雜志，2015，21（1）：104-105.

［6］Stollman N，Metz DC.Pathophysiology and prophylaxis of stress ulcer in intensive care unit patients［J］.J Crit Care，2005，20（1）：35-45.

［7］ Buttram SD，Wisniewski SR，Jackson EK，et al.Multiplex assessment of cytokine and chemokine levels in cerebrospinal fluid following severe pediatric traumatic brain injury：effects of moderate hypothermia［J］.J Neurotrauma，2007，24（11）：1707-1717.

［8］戴梅，蒙燁，黃永坤，等.支氣管肺炎患兒的腸黏膜屏障測定及臨床意義［J］.昆明醫科大學學報，2013，34（6）：71-74.

［9］ Wang HL，Yu KJ.Sequential blood purification therapy for critical patients with hyperlipidemic severe acute pancreatitis［J］.World J Gastroenterol，2015，21（20）：6304-6309.

［10］侯維，孟慶華.腸黏膜屏障功能的損傷與修復［J］.中國全科醫學，2010，13（20）：2295-2297.