傷科消痛酒微生物限度檢查方法的適用性試驗

鐘柳芳 肖文可

傷科消痛酒為廣州市番禺區中醫院醫院制劑的一種外用中藥復方洗劑，其具有清熱、散瘀止痛、活血消腫等功效。臨床主要用于跌打諸證、風濕痛證等病證，該類中成藥常具有消炎、抑菌及殺菌的作用。為了更加準確地體現出藥品微生物的污染情況，需要采取實驗來對藥品的抑菌作用進行消除。本研究探討傷科消痛酒對微生物限度檢查方法的適應性進行試驗，以便研究出基于傷科消痛酒進行微生物限度的檢查方法，提高醫院制劑的安全性，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器霉菌培養箱[上海躍進醫療器械廠生產，批準文號：滬食藥監械（準）字2009第2411044號]；生化培養箱[上海博迅實業有限公司醫療設備廠生產，批準文號：滬食藥監械（準）字2011第2411164號]；電熱恒溫水浴箱（廣東環凱微生物科技有限公司生產，型號：WBK-4A）；全自動電熱壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫療設備公司生產，型號：YM302）；無菌檢查儀（天津市羅根科技有限公司生產，型號：WJ-6）；快速混合儀（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠生產，型號：SZ-1）；生物安全柜（蘇凈集團蘇冊安泰空氣技術有限公司生產，型號：BHC-1300ⅡA2）。

1.2 供試藥品傷科消痛酒（廣州市番禺區中醫院制劑室提供，規格：20g/50ml）。

1.3 培養基廣東環凱微生物科技有限公司提供本實驗培養基，包括胰酪大豆胨瓊脂培養基、胰酪大豆胨液體培養基、沙氏葡萄糖瓊脂培養、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基等。

1.4 菌株菌株均為第三代，黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003，中國藥品生物制品檢定所提供]；銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌[P.Aeruginosa，CMCC（B）10104]、金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]、白色念珠菌[Monilia albican 或 Canidia Albicans，CMCC（F）98001]及枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，CMCC（B）63501]，上述四種菌株均由中國醫學細菌保藏管理中心提供。

2 試驗方法

2.1 菌液的制備根據2015年版《中華人民共和國藥典》的相關規定及要求[1]，試驗組和菌液對照組均采用溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基，在胰酪大豆胨液體培養基中將銅綠假單胞菌的新鮮培養物接種到胰酪大豆胨液體培養基中，同時對金黃色葡萄球菌實施接種，放置環境條件為33 ℃，培養24 h；沙氏葡萄糖液體培養基接種白色念珠菌新鮮培養物；枯草芽孢桿菌新鮮培養物接種到胰酪大豆胨瓊脂培養基中；0.9%無菌氯化鈉溶液應用上述培養物中，配置菌懸液，含菌數≤100 cfu/ml的菌懸液。采用甘露醇氯化鈉瓊脂培養基培養黑曲霉新鮮培養物120 h，然后接種、孢子洗脫，采用5 ml含0.05%聚山梨酯80（大連廣會科技有限公司，批準文號：國藥準字H21021050，批號：86901256000021）的 0.9%無菌氯化鈉溶液配置孢子懸液，無菌毛細吸管放置到無菌試管中以便配置孢子懸液，懸液孢子數控制在100cfu/ml以下。

2.2 供試液的制備將10 ml供試品加到pH為7的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液中，溶液體積為 100 ml，制作供試液。

2.3 菌株培養選用制備好的供試液1 ml，添加到pH為7的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml，然后將2.1項下制備的菌液1 ml加入其中，充分搖勻，以薄膜方式實施過濾，單次過濾均使用緩沖液 600 ml，分批次沖洗，最終取出濾膜，置于相應瓊脂平皿中，按照《中華人民共和國藥典》有關要求進行培養。需氧菌總數計數的試驗菌株及真菌和酵母菌對應試驗的培養基分別為胰酪大豆胨瓊脂培養基和沙氏葡萄糖瓊脂培養基[2]，所有試驗菌株需要操作2次。

2.4 金黃色葡萄球菌檢查適用性試驗取10 ml上述方法制備的供試液進行薄膜過濾，采用pH為7的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至 600 ml，單次沖洗液容量100 ml，沖洗5次，然后于第6次沖洗時加入含50～100 cfu的銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌的混懸液1 ml，過濾，取出濾膜，在室溫30～35 ℃條件下在培養基中接種胰酪大豆胨液體 100 ml，甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板中接種培養 24 h。溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板也需要進行相應接種，接種方式為劃線接種，培養 18～72 h，最后對結果進行觀察。

2.5 供試品對照組采取不加試驗菌株的稀釋液替代供試液，按照供試液的制備方法來進行操作。

2.6 計數方法適用性試驗的回收率計算方法：試驗組菌回收率比值=試驗組菌落數/菌液對照組菌落數－供試品對照組菌落數/菌液對照組菌落數[3]，采用薄膜過濾法作為本次試驗的計數方法。

3 結果

3.1 需氧菌總數計數適用性試驗結果薄膜過濾法可使黑曲霉、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的回收率比值均高于 0.70以上，見表1。

表1 需氧菌總數計數適用性試驗結果

3.2 真菌和酵母菌總數計數適用性試驗結果薄膜過濾法可使真菌和酵母菌的回收率比值均高于0.70以上，見表2。

表2 真菌和酵母菌總數計數適用性試驗結果

4 結論

傷科消痛酒屬于中藥復方洗劑，其常作為跌打損傷、風濕疼痛的外用療法之一，具有較強的抗炎、殺菌、抑菌作用，方中大黃具有清熱解毒、涼血祛濕的功效，對革蘭陽性菌及部分革蘭陰性菌具有較強的抑菌作用[4]，白酒具有散寒止痛的功效，消炎抑菌效果也較為明顯[5]。而抑菌作用對微生物限度檢查會產生一定的影響[6-7]。為保證檢驗質量，根據國家藥典委員會、中國藥品生物制品檢定所相關規定[8-9]，對傷科消痛酒的微生物限度進行檢查，并進行計數方法學驗證、控制菌檢查方法驗證。薄膜過濾法常用于檢測中藥液體制劑，以消除藥物的抑菌作用，使檢查結果更具有效性。

本研究按照《中華人民共和國藥典》2015年版規定，采用薄膜過濾法探討傷科消痛酒微生物限度檢查方法的適用性試驗。結果顯示，薄膜過濾法可使黑曲霉、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的回收率比值均高于 0.70；真菌和酵母菌總數計數適用性試驗結果顯示，薄膜過濾法可使真菌和酵母菌的回收率比值高于0.70；5種驗證菌株的菌落數比值均在0.5～2.0，符合驗證要求。上述結果表明，可以采用此種方法對傷科消痛酒進行微生物限度控制菌檢查。

本研究采用直接稀釋法來稀釋本樣品，反饋結果表明，3種試驗菌株的回收率比全部在0.5以下，所以，聯合薄膜過濾法的目的在于將供試品的抑菌活性消除。薄膜過濾法驗證結果準確、可靠、重現性好，適用于傷科消痛酒的微生物限度檢查。

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