松郁安神方對異相睡眠剝奪大鼠海馬CREB表達的影響

曾雪愛 ，周春權 ，王秀峰 ，張一帆 ，黃俊山 （1.福建省中醫藥研究院，福建 福州 350003；2.福建省中醫睡眠醫學重點實驗室，福建 福州 350003）

睡眠是機體復原、整合和鞏固記憶的重要環節，是維持生命所必須的過程，根據睡眠過程中腦電圖、眼球運動情況，睡眠可分為快速眼球運動（rapid eye movement，REM）和非快速眼球運動（non rapideye movement，NREM）兩個時相。其中 REM 睡眠亦稱異相睡眠（paradoxical sleep），它對于保證學習、記憶和情感等大腦高級功能正常具有非常重要的作用［1］。隨著生活節奏的加快和社會競爭的增加，睡眠障礙或睡眠相關疾病的發生率逐年增加，越來越多的人處于慢性睡眠剝奪狀態。長期睡眠不足或異相睡眠剝奪（paradoxical sleep deprivation，PSD）嚴重影響人們的生活質量、身心健康和學習記憶。松郁安神方是黃俊山教授臨床上治療失眠的經驗效方，臨床上用于治療失眠療效顯著。前期實驗已證實該方能改善REM睡眠剝奪所致的大鼠學習記憶能力下降［2］，本實驗進一步通過檢測大鼠海馬學習記憶的關鍵蛋白——cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的表達和變化，探討松郁安神方改善PSD大鼠學習記憶能力的作用機制。

1 材料

1.1 動物 健康雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級，體質量（200±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。動物置于實驗環境中飼養3 d，給予充足食物和水。實驗前將大鼠隨機分為4組：對照組、PSD模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組5只。

1.2 主要藥品與試劑 RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；SYBR Premix Ex Taq（大連TaKaRa公司）；細胞裂解液、PMSF（碧云天生物技術有限公司）；蛋白 Marker（美國 Thermo 公司）；一抗：CREB及 p-CREB（美國 Cell Signaling Technology公司）；GAPDH（美國 Cell Signaling Technology公司）；二抗：辣根過氧化物酶標記二抗（美國 SAB公司）；顯影液（美國Thermo公司）；引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。中藥松郁安神方由福建省中醫藥研究院提供。

1.3 主要儀器 睡眠剝奪裝置（中國醫學科學院藥物研究所）；微量紫外分光光度計（美國Thermo公司）；7 500 fast型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；蛋白電泳和電轉儀（美國Bio-Rad公司）；Alpha多色熒光、化學發光凝膠成像系統（美國ProteinSimple公司）。

2 方 法

2.1 PSD模型建立 采用改良多平臺睡眠剝奪法建立模型［3］。每次取8只大鼠放入睡眠剝奪裝置內，內有9個小平臺，平臺直徑6.5 cm，平臺周圍注滿水，平臺高出水面約1.0 cm。當大鼠進入異相睡眠時，由于全身肌肉張力降低，出現垂頭觸水而覺醒，使動物不能進入異相睡眠，連續睡眠剝奪96 h。對照組采用與睡眠剝奪組一樣的裝置，只是把大鼠放在直徑為12.0 cm的大平臺上，在大平臺上的動物能夠進入異相睡眠，使其所處環境與其它組完全一致。2.2 給藥方法 睡眠剝奪第1天開始進行灌胃給藥。松郁安神方由甘松10 g，郁金15 g，玫瑰花10 g，丹參 15 g，酸棗仁 15 g，首烏藤 30 g，珍珠母30 g，生龍骨30 g，合歡皮 15 g組成，藥材加 10倍量的水浸泡30 min，珍珠母和生龍骨先煎30 min后，加入其余中藥，先武火煮沸，再文火煮30 min，過濾，殘渣加水煎煮，重復2遍，合并濾液，濃縮至所需濃度。中藥高劑量組、中藥低劑量組分別按34 g／kg、17 g／kg體質量灌胃給藥，對照組和PSD模型組均給予等體積蒸餾水，每天1次，共7 d。于第7天灌胃2 h后取材，在冰面上迅速分離海馬組織，-80℃冰箱保存。

2.3 實時熒光定量PCR檢測 總RNA提取參照試劑盒說明書進行。提取的總RNA純度及完整性檢測后，選用天根Quant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA。在進行RT-PCR實驗前，用普通PCR檢驗引物的特異性，PCR擴增產物用1.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR反應體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×） 10 μL，50×ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，上下 游 引 物分別 為 1 μL，cDNA 模 板 7.5 μL，加DEPC水補至20 μL。PCR的反應條件為：95℃預變性 30 s，95℃變性 3 s，60℃延伸 30 s，40 個循環。

2.4 蛋白印跡法檢測 取海馬研磨，使組織細碎，加入裂解液，置于冰上裂解，勻漿液離心，采用微量紫外分光光度計測定組織總蛋白含量。總蛋白按1∶1加入2×上樣緩沖液，混勻，變性處理后進行蛋白印跡法檢測，其步驟大致如下：經過灌膠、加樣、電泳、轉膜后，將膜放入5%脫脂奶粉封閉液置室溫搖床上封閉 2 h，加一抗（CREB，兔抗，1∶500；p-CREB，兔抗，1∶500；GAPDH，兔抗，1∶1 000）于 4℃孵育過夜。然后加入辣根過氧化物酶標記（HRP）的二抗（羊抗兔 1∶5 000），二抗室溫搖床上孵育 1 h，最后將膜正面朝上放置在顯影板上，曝光顯影。用AlphaView SA軟件分析光密度，根據光密度對蛋白條帶進行分析，以GAPDH作為內參，計算目的蛋白與內參光密度比值。將對照組的光密度比值設定為1，其余各組與對照組的比值作為最后結果進行統計。

2.5 統計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行數據分析。計量資料屬正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 松郁安神方對PSD大鼠海馬CREB mRNA表達的影響 實時熒光定量PCR結果顯示：連續睡眠剝奪96 h后，大鼠海馬CREB mRNA表達明顯降低，相對表達量為（0.63±0.10），與對照組比較有統計學意義（P＜0.01）；不同劑量松郁安神方干預后CREB mRNA表達明顯升高，并呈明顯的劑量效應，中藥高劑量組相對表達量為（0.86±0.09），與模型組比較有統計意義（P＜0.01），中藥低劑量組相對表達量為（0.75±0.08），差異也有統計學意義（P＜0.05）。 見圖 1。3.2 松郁安神方對PSD大鼠海馬CREB蛋白表達的影響 蛋白印跡法結果顯示：連續睡眠剝奪96 h后，大鼠海馬磷酸化CREB（p-CREB）蛋白表達降低，相對表達量為（0.63±0.03），與對照組比較，有統計學意義（P＜0.01）；中藥高、低劑量組干預后p-CREB表達明顯升高，中藥高劑量組相對表達量為（0.91±0.03），中藥低劑量組相對表達量為（0.78±0.09），與模型組比較，均有統計學意義（P＜0.01）。見圖2。

圖1 4組PSD大鼠海馬CREB mRNA表達量比較

圖2 4組PSD大鼠海馬p-CREB蛋白表達量比較

4 討 論

在異相睡眠期，除眼肌和中耳肌外，其它肌肉尤其是頸后肌和四肢肌肉的張力極度下降，不能維持某種姿勢［3］，改良多平臺睡眠剝奪法是根據這一原理設計。此外，為了避免水環境對動物造成一定的應激反應，本實驗采用大平臺進行對照。大平臺的直徑允許大鼠進入異相睡眠，其他環境均與小平臺相同。目前該方法是研究睡眠剝奪較常用且成熟的動物模型建立方案。

學習記憶與睡眠是相互影響的過程，學習記憶能影響睡眠的結構和時間，睡眠也可對覺醒時所獲信息進行加工、整理并鞏固成長時記憶，其中，異相睡眠與學習記憶關系較大。有研究報道：異相睡眠剝奪對大鼠的學習記憶能力存在一定的損害，其學習和記憶的獲得與鞏固過程下降［4］；異相期睡眠剝奪可引起大鼠空間參考記憶能力低下［5］。

CREB是一種關鍵的核轉錄因子，在各系統中均發揮著重要的作用，能調節神經可塑性相關基因的表達［6］。很多與睡眠相關的神經遞質和調質可影響腦內cAMP的含量［7］。當神經遞質與細胞膜上的特異受體結合后，激活腺苷酸環化酶，水解生成第二信使cAMP，cAMP進一步激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），即激活cAMP-PKA信號通路，CREB在神經系統中通常作為許多信號通路的終止與交匯點，其調控的上下游信號分子及其靶基因和CREB一起參與了神經細胞存活、再生、分化等過程，與突觸的可塑性和學習記憶等正常生理活動密切相關［6，8］。 研究表明：睡眠剝奪阻礙海馬 cAMPPKA信號通路，可擾亂認知過程［9］。對嚙齒動物的研究也表明：REM睡眠剝奪能降低海馬磷酸化CREB （P-CREB）水平［10］。可見海馬中磷酸化 CREB水平與學習記憶關系密切。

松郁安神方既能改善大鼠REM睡眠剝奪大鼠的學習記憶能力［2］，又能夠鎮靜安神，增加睡眠時間和深度，從而改善記憶。本實驗結果顯示：REM睡眠剝奪96 h后，大鼠海馬CREB mRNA及磷酸化CREB蛋白表達均降低，這與之前的研究報道一致。松郁安神方干預后，能明顯升高海馬CREB mRNA及磷酸化CREB蛋白表達，提示松郁安神方改善大鼠學習記憶能力可能通過調節CREB而發揮作用。但該方是否進一步調控CREB相關的信號通路，還有待于進一步的研究。

參考文獻：

［1］ 尹貞云，趙忠新.鎮靜催眠作用藥物對失眠患者睡眠結構的影響［J］.中華神經科雜志，2010，43（1）：69-71.

［2］ 曾雪愛，黃俊山，王雅麗.松郁安神方對REM睡眠剝奪大鼠認知功能及神經遞質的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2012，18（4）：392-393，397.

［3］ 黃建歐，趙忠新.大鼠睡眠剝奪方法的研究進展［J］.中華神經醫學雜志，2004，3（3）：229-230.

［4］ 葉晨靜，趙忠新.快速眼球運動睡眠剝奪對大鼠學習、記憶能力及其海馬組織腦源性神經營養因子表達的影響［J］.第二軍醫大學學報，2007，28（1）：82-86.

［5］ 張微勝，侯一平，王德貴，等.異相睡眠剝奪對大鼠空間學習記憶的影響［J］.中國行為醫學科學.2004，13（5）：496-498.

［6］ HEYWARD P．Presenilin dysfunction leads to memory and plasticit defects ［J］．Lancet Neurol，2004，3（6）：327．

［7］ 朱國慶，張惠秀，王敏，等.中樞應用外源性cAMP和ATP對大鼠睡眠的影響［J］. 中國應用生理學雜志，1993，9（2）：189-190.

［8］ LONZE B E，GINTY D D.Function and regulation of CREB family transcription factors in the nervous system ［J］.Neuron，2002，35（4）：605-623.

［9］ LUO J，PHAN T X，YANG Y，et al.Increases in cAMP，MAPK activity，and CREB phosphorylation during REM sleep：implications for REM sleep and memory consolidation ［J］.J Neurosci，2013，33（15）：6460-6468.

［10］ ALHAIDER I A，ALEISA A M，TRAN T T，et al.Sleep deprivation prevents stimulation-induced increases of levels of P-CREB and BDNF：protection by caffeine ［J］.Molecular and Cellular Neuroscience，2011，46（4）：742-751.