大鼠電針后血清對腫瘤壞死因子α誘導凋亡軟骨細胞Erk1／2、C-Myc、C-Fos和 C-Jun 基因表達的影響

林 潔 ，吳廣文 ，付長龍 ，洪秀娥 ，李 俐 ，林秋祥 ，吳明霞

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003；3.福建中醫藥大學康復醫學院，福建 福州 350122）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種常見老年性多發疾病，發病部位常見于膝關節，表現為疼痛、腫脹、活動受限等，嚴重影響患者生活質量［1］。OA在中醫學上屬“痹證”范疇，以肝腎虧虛為病變根本，風寒濕邪是其致痹外因，病機總屬本虛標實、本痿標痹［2-3］。電針作為傳統針灸療法與現代電療結合產物，具有舒經活絡、行氣活血、消炎鎮痛之效，對防治OA具有良好療效［4-5］。前期研究表明：電針具有抑制軟骨細胞凋亡、延緩OA關節軟骨退變、促進關節軟骨修復的作用［6-8］。本實驗擬觀察電針刺激大鼠內外膝眼一定時間后獲得的血清（電針后血清）對TNFα誘導的大鼠體外軟骨細胞凋亡模型的影響，并檢測其 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表達情況，從而進一步闡明電針防治OA的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物 2月齡SD雄性大鼠30只、4周齡SD雄性大鼠12只購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2012-0002。實驗動物飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（閩）2014-0005，分籠飼養，自由飲水，標準飼料喂養。

1.2 實驗試劑 磷酸鹽緩沖液（PBS）、低糖型DMEM培養基、胎牛血清、二型膠原酶、0.25%胰蛋白酶（美國 Hyclone公司）；腫瘤壞死因子 α（TNFα，美國Sigma 公司）；Annexin V-FITC／PI凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司）；逆轉錄試劑盒（日本TAKARA公司）；PCR引物 （上海鉑尚生物技術有限公司）；諾唯贊qPCR SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 華佗牌SD-Ⅱ型電子針療儀、華佗牌一次性不銹毫針，規格：13 mm×0.25 mm（蘇州醫療用品廠有限公司）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司）；CO2培養箱（香港力康生物醫療科技控股有限公司）；相差倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；流式細胞儀（美國BD公司）；PCR儀 （美國 Applied Biosystems公司）；7500 Fast型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

2 實驗方法

2.1 血清制備 2月齡SD雄性大鼠30只，應用隨機數字表法分為正常組（n＝10）、電針15 min組（n＝10）和電針 30 min 組（n＝10）。 正常組常規飼養，電針15 min組和電針30 min組分別予電針刺激大鼠雙側膝關節內、外膝眼，刺激時間分別為每次15 min、30 min，每天 1次，連續干預 1周。1周后，大鼠在麻醉狀態下行腹主動脈采血，經離心獲取正常組、電針15 min組和電針30 min組血清，于56℃水浴滅活30 min及過濾除菌后，-20℃保存，細胞實驗時用DMEM配制為10%濃度進行干預。

2.2 軟骨細胞提取與培養 采用2%戊巴比妥鈉麻醉4周齡SD大鼠，每次4只，分3批次提取軟骨細胞。用剪刀離斷并取出雙膝關節，在潔凈臺上，分離、切取雙膝軟骨，剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小后，用4 mL 2%Ⅱ型膠原酶于37℃培養箱消化2 h；消化后，收集上清液于15 mL離心管中，以1 000 rpm的速度離心5 min獲得軟骨細胞；用4 mL含10%胎牛血清的DMEM培養液重懸軟骨細胞沉淀，并接種25 cm3培養瓶，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。上述步驟重復4次。于倒置顯微鏡下觀察細胞每日生長情況，待細胞長滿至85%～90%后傳代培養，每隔48 h后更換培養液。以2代軟骨細胞為實驗對象，調整細胞密度為 1×105個／mL，取 2 mL接種于六孔板中，培養72 h后進行實驗。

2.3 軟骨細胞干預方法 參考文獻［9］，采用10 ng／mL TNFα誘導軟骨細胞凋亡。將第2代軟骨細胞隨機分為正常組、模型組、電針15 min組和電針30 min組。正常組予正常組血清2 mL干預，模型組予含10 ng／mL TNFα正常組血清2 mL干預，電針15 min組予含10 ng／mL TNFα電針15 min組血清2 mL干預，電針 30 min組予含10 ng／mL TNFα電針30 min組血清2 mL干預。各組同時進行干預，干預48 h后檢測相應指標。

2.4 檢測指標

2.4.1 軟骨細胞凋亡率 干預軟骨細胞后，用移液槍吸棄培養液，PBS清洗1次，吸棄PBS，用不含EDTA的胰酶消化軟骨細胞，收集于流式管中，2 000 rpm離心5 min，調整細胞密度為1～5×105個／mL。流式管每管加入500 μL Binding Buffer重懸軟骨細胞，再加入FITC和PI各5 μL，混勻并于室溫避光孵育15 min，用流式細胞儀檢測各組軟骨細胞凋亡率。

2.4.2 軟骨細胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表達 如2.3干預軟骨細胞后，用Trizol法提取各組軟骨細胞總RNA，取1 μg RNA按照TAKARA逆轉錄試劑盒使用說明書逆轉錄成cDNA。按照諾唯贊qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書進行操作，以各組cDNA為模板行實時熒光定量PCR檢測，β-actin為內參，具體引物序列如下：

表1 引物序列表

實驗反應分為三個階段：預熱階段為95℃3 min； 循環階段為 95℃ 10 s、60℃ 30 s， 循環 40次；溶解曲線階段為 95℃ 15 s、60℃ 30 s、95℃ 15 s。實驗結束后，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

2.5 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件統計分析。計量資料屬正態分布的以（x±s）表示，采用t檢驗；不符合正態分布采用非參數檢驗。

3 實驗結果

3.1 軟骨細胞形態觀察 剛提取的軟骨細胞 （即原代軟骨細胞）懸浮于培養液中（圖1A），原代軟骨細胞培養24 h后開始貼壁，培養48 h可見軟骨細胞成簇現象（圖1B），以梭形或橢圓形生長。細胞數量較多時，可呈典型的“鋪路石”狀。第1代及第2代軟骨細胞狀態良好，細胞的增殖速度較快，增殖及分泌基質的能力較強，其中第2代軟骨細胞較為純化，更適合作為實驗對象（圖1C、圖1D）。

3.2 各組軟骨細胞凋亡率 電針后血清對TNFα誘導軟骨細胞凋亡的影響如圖2所示，正常組凋亡率為（6.22±0.13）%，模型組凋亡率為（26.49±0.79）%，2組比較有顯著性差異 （P＜0.05）。 電針15 min組凋亡率為（16.81±1.71）%，電針 30 min組凋亡率為（13.88±0.83）%，2組與模型組比較均有顯著性差異（P均＜0.05）。

圖1 軟骨細胞形態觀察（×100）

3.3 軟骨細胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表達與正常組比較，模型組在 Erk1 ／2、C-Myc、CFos、C-Jun 表達均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，電針 15 min組與電針 30 min組的 Erk1／2、CMyc、C-Fos、C-Jun基因表達均顯著降低（P均＜0.05）。 見表 2、圖 3。

4 討 論

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proyein kinases，MAPKs）信號轉導通路存在于大多細胞內，

圖2 各組軟骨細胞凋亡情況

圖3 各組軟骨細胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun基因表達情況

表 2 各組軟骨細胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因表達結果（x±s）

其將細胞外刺激轉導至細胞及其核內，引起細胞增殖、分化、凋亡等生物學反應。目前，在哺乳類細胞已發現存在著 ERK通路、JNK／SAPK通路、P38 MAPK通路三條并行的MAPKs信號通路。近年來，ERK通路（即Ras-Raf-MEK-ERK信號連級通路）的細胞生物學作用越來越受到重視，有學者認為ERK通路表達上調一方面能促進軟骨細胞增殖，形成明顯骨贅，另一方面可能會加快軟骨細胞凋亡，引起細胞結構破壞、細胞外基質降解［10-11］。該信號通路可被多種細胞外刺激信號激活，激活的Erk1／2進一步促使C-Myc、C-Fos、C-Jun轉錄因子磷酸化來調節基因表達，進而參與調節細胞增殖、分化和凋亡［12-13］。 相關研究表明：C-Myc、C-Fos、C-Jun 參與多種細胞凋亡活動［14-17］。此外有研究顯示：TNFα能激活Ras-Raf-MEK-ERK信號通路，促進IL-1β表達，提高MMPs活性，并與激活產物進一步發生協同作用，促使細胞外基質降解、軟骨細胞凋亡［18-20］。

本實驗結果顯示：TNFα誘導的大鼠凋亡軟骨細胞經其電針后血清干預后，細胞凋亡率明顯下降，各組軟骨細胞 Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 的基因表達顯著降低，表明大鼠電針后血清能有效抑制TNFα誘導的軟骨細胞凋亡，其機制可能與下調Erk1／2、C-Myc、C-Fos、C-Jun 基因的表達有關。

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