肝病實脾法對急性肝損傷小鼠肝抗氧化能力的影響

王 洋，林振昆，曾友強，李秀娟，殷娉宇，郭明章

（福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122）

實脾法是中醫藥治療肝病的一個重要治法，早在《難經》《金匱要略》中就提出了“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”的觀點，該治法體現了中醫治病的整體觀和治未病的思想，其強調“實脾”的觀點對現代臨床治療肝病具有重要的指導意義，但該治法對肝損傷防治作用的影響機制尚在探討。益氣健脾法是中醫治療肝病中常用的“實脾”法之一［1-5］。本研究用健脾益氣方四君子湯與治療肝病的常用經方四逆散，分別單方使用、兩方合用做為造模前的治療性干預用藥，擬采用尾靜脈注射刀豆蛋白（ConA）法建立小鼠急性肝損傷模型，探討肝病實脾法對急性肝損傷小鼠肝抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級6～8周齡健康BALB／C雄性小鼠50只，體重（20±2）g，上海斯萊克實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCK（滬）2012-0002。

1.1.2 藥物及制備 四君子湯、四逆散、四君子湯與四逆散合方均按《方劑學》［6］規定的劑量比例稱取。四君子湯組成：黨參10 g，白術10 g，茯苓10 g，炙甘草5 g；四逆散組成：柴胡10 g，赤芍10 g，枳殼10 g，炙甘草5 g。四君子湯與四逆散組即以上兩方劑量合用。以上均按傳統方法水煎，煎煮2次，取2次水煎液合并后濃縮成含生藥量約1 g／mL，置4℃保存備用。

1.1.3 試劑與儀器 ConA（德國Sigma公司）；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）、血清丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Infinite M200多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；3K15低溫離心機（德國Sigma公司）；AE100電子天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）。

1.2 模型制備及給藥方法 50只BALB／C雄性小鼠隨機分成5個組，每組10只，分別為對照組、模型組、四君子湯組、四逆散組、四君子湯合四逆散組。在造模前對各組給予灌胃給藥，給藥劑量為0.02 mL／g鼠重。其中對照組、模型組給予蒸餾水灌胃，四君子組給予四君子湯濃縮液，四逆散組給予四逆散湯濃縮液，四君子湯合四逆散組給予四君子湯合四逆散湯濃縮液，每天1次，連續給藥4 d。在最后1次給藥后4 h造模，行靜脈注射2 mg／mL ConA 0.2 mL／只，ConA溶解于1×PBS里，以誘導肝損傷，其中正常組小鼠均給予尾靜脈注射PBS 2 mL／只［7－8］。各組小鼠于造模后6 h行目內眥靜脈叢取血，頸椎脫臼處死，解剖動物取部分肝組織剪碎，置于液氮中固定后，于-80℃保存。

1.3 血清AST、ALT、NO測定 實驗中通過目內眥靜脈叢取血，全血離心，取上清液，按照AST、ALT、NO試劑盒進行測定。

1.4 肝組織勻漿MDA、SOD、GSH測定 準確稱取于-80℃保存的小鼠肝臟，加入9倍預冷的生理鹽水，勻漿，離心后取上清液，按 MDA、SOD、GSH試劑盒說明書進行測試，同時測定小鼠肝臟的蛋白質含量（考馬斯亮藍法）。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，采用t檢驗，不符合正態分布采用非參數檢驗。

2 結 果

2.1 各組小鼠血清ALT、AST、NO比較

2.2 各組小鼠肝組織勻漿MDA、SOD、GSH比較

表1 各組小鼠血清ALT、AST、NO比較（x±s）

表2 各組小鼠肝組織勻漿MDA、SOD、GSH比較（x±s）

3 討論

根據中醫理論，生理狀態下肝木能對脾土行使疏泄條達之能，脾胃之氣升降暢通，運化水谷精微也可滋養肝木，構成肝脾生理功能的協調。一旦肝失疏泄而肝氣郁結，橫逆犯脾，會導致脾胃虛弱，而脾胃功能的失調也影響了肝疏泄條達機能的恢復。本實驗中以四逆散方做為常規治療肝病的治肝方，四逆散是疏肝理氣的常用經方，具有調理氣機，宣通郁滯，解郁開結，益氣生新的功效，在臨床上常用于治療病毒性肝炎，近來亦有實驗研究表明四逆散有良好的抗肝損傷作用［9-10］，而四君子湯是中醫傳統名方，具有健脾益氣之功效，常在肝病治療中做為實脾法運用。而ConA誘導的小鼠急性免疫性肝損傷模型，被認為能夠較好地模擬人類病毒性肝炎等免疫性肝病的病理變化，常應用于其發病機理及其治療藥物的作用機制研究［11-12］。本研究采用了ConA誘導的小鼠急性免疫性肝損傷模型，并以四君子湯方做為實脾法的代表方，同時設了一組四君子湯與四逆散的合方以探討肝病實脾法對急性肝損傷小鼠肝組織抗氧化能力是否具有保護作用。

血清中ALT和AST的水平是代表肝臟損傷的程度。NO在肝損傷過程中有雙重作用，研究表明：NO在肝損傷過程中早期可對肝臟起保護作用；但當NO在肝臟中的濃度遠遠高于其生理濃度時，則其可通過抑制線粒體呼吸、抑制肝細胞蛋白質的合成，導致肝細胞的DNA斷裂、肝組織細胞脂質過氧化和細胞毒性損傷，間接改變細胞內的cAMP含量、使肝細胞對TNF-α敏感性的提高等機制造成肝細胞損害、壞死。MDA是氧化應激狀態下產生的重要的脂質過氧化產物，可趨化中性粒細胞，還可導致致炎因子表達和釋放增加而產生炎癥，其水平高低反映了脂質過氧化導致肝損傷的程度［13］。在本研究中模型組的小鼠血清中ALT、AST、NO及肝組織中的MDA水平較正常組、對照組顯著升高，說明因ConA的誘導造成了小鼠嚴重的肝損傷。而四君子湯、四逆散、四君子湯合四逆散合方均使血清中ALT、AST、NO和肝組織中MDA水平降低，并且這4個指標在3個治療組間也部分存在顯著性差異，說明實脾法和疏肝理氣法對免疫性肝損傷中的ALT、AST、NO、MDA水平能起到降低的作用，而健脾益氣方與治肝方聯合使用時療效更為顯著，符合中醫的在肝病治療中同時運用實脾法能提高療效的理論。

SOD和GSH都是肝組織中重要的抗氧化酶，在減輕肝組織過氧化損傷中起到重要作用。SOD能清除超氧陰離子自由基而保護細胞，是生物體內第一道抗氧化防御體系。當肝細胞受到自由基攻擊時，通過SOD與自由基作用而減少肝細胞的損傷。同時SOD還與體內的第二道乃至更多的抗氧化防御體系有機的配合，以減少細胞損傷。GSH可直接通過供H＋拮抗氧自由基毒性，清除體內的超氧離子及其他自由基，防止肝細胞損傷。因GSH具有強大的還原作用而使肝細胞膜對氧自由基的耐受性增加，從而保護肝細胞膜，使肝細胞膜穩定性增加、肝酶降低。

本研究中小鼠肝組織的GSH水平與正常對照組相比，僅四君子湯合四逆散組有顯著降低，其余各組均無顯著差異，這可能與急性肝損傷所造成的免疫反應時間尚短，體內GSH消耗不太明顯有關。而健脾益氣方與治肝方聯合使用，能提高GSH的抗氧化能力，加速GSH的損耗，所以導致其GSH水平下降明顯，這可能也是健脾益氣方與治肝方聯合使用能有效降低ALT、AST、NO、MDA水平的原因。但在肝損傷持續時間較長的情況中，肝病實脾法能否提高肝臟中抗氧化酶的水平還需做進一步探討。

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