去卵巢老年大鼠軟骨退變與E2、MMP-13、TNF-α的相關性

KHOO YEW LEE，周 逸 ，張 俐 ，2

（1.福建中醫藥大學，福建 福州 350122；2.廈門醫學院，福建 廈門 361023）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是臨床常見的關節病，以關節軟骨病變為特征，關節屈伸不利等為臨 床 表 現［1］， 其 中 膝 骨 關 節 炎 （knee osteoarthritis，KOA）危害性最大，發病嚴重時可導致骨關節無法正常運動［2］，致殘率高達 53%［3］。 據國內調查統計，KOA患者以年齡55歲居多，60歲以上患者占老年人群里約85%［4-5］，隨著年齡遞增，發病率越高。前期研究表明：KOA與女性絕經后雌激素水平的改變密切相關，勞損是KOA的重要誘因之一［3］。KOA的女性患者也隨著年齡、生理及病理改變而逐年增加［6］。本實驗建立6月齡去卵巢鼠勞損性膝骨關節炎模型，模擬臨床老年女性膝骨關節炎發生后，探討 E2、MMP-13、TNF-α 與軟骨退變的相關性，為臨床防治本病提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6月齡SPF級SD雌性大鼠24只，體質量（438±21）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證書號：SCXK（滬）2012-0002，飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF級動物房，合格證號：2009-0001。

1.2 實驗儀器與試劑 石蠟切片機（HM315，美國Thermo公司）；生物組織攤烤片機（YT-7FB，湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司）；高速離心機（HC-2514，科大創新股份有限公司中佳分公司）；CAVALLO烤箱 （中山佳威路家用電器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9023A，上海精宏實驗設備有限公司）；大鼠跑步臺（ZH-PT，淮北正華生物儀器設備有限公司）；TECAN INFINITE M200PRQ多功能型酶標儀（瑞士Tecan公司）；DMI 4000B型生物倒置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.3 實驗試劑 硫酸慶大霉素注射液8萬U（福州海生福王制藥有限公司）；0.9%氯化鈉（福州沃森生物技術有限公司）；ELISA大鼠血清 E2試劑盒、ELISA大鼠關節液TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；伊紅染色液、Cole氏蘇木素染色液、正常非免疫山羊血清（北京索萊寶科技有限公司）；即用型免疫組織化學UltraSensitiveTM SP試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）；MMP13 Rabbit Polyclonal antibody抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制備 將24只6月齡SD雌性大鼠按數字表法隨機分為對照組、去卵巢組和去卵巢＋跑步組各8只。對照組予常規飼養；去卵巢組行雙側卵巢切除術；去卵巢＋跑步組行雙側卵巢切除術＋大鼠跑臺做跑步疲勞訓練。雙側卵巢切除術操作方法：每只大鼠按3 mL／kg劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液使大鼠麻醉；麻醉后以8%的硫化鈉溶液對大鼠劍突至下腹部行脫毛處理；脫毛后，沿前正中線用碘伏消毒，打開腹腔以4號手術線結扎輸卵管上段，再去除雙側卵巢及輸卵管；術后于腹腔滴入1 mL青霉素（8萬U）水溶液，關腹縫合并常規飼養［7］。去卵巢＋跑步組大鼠雙側卵巢切除術后7 d進行跑步疲勞訓練，使用大鼠跑步臺做跑步疲勞訓練，訓練設定均度15 m／min，行動物適應性實驗期2 d；隨后改變均速為30 m／min，間隔5 min，2 次 ／d，上坡坡度為 16°，連續訓練 35 d［6］。

2.2 取材 造模5周后，于取材室將大鼠以10%水合氯醛水溶液0.3 mL／100 g行腹腔內麻醉后予以下操作：① 沿腹中線切開腹腔，鈍性游離臟器，暴露腹主動脈，以采血針與腹主動脈約15°刺入腹主動脈，再將另一頭連接抗凝管，采集腹主動脈血后靜置1～2 h，再予離心機以3 000 rmp離心20 min，取血上清液，于－80℃凍存。行腹主動脈抽血后處死大鼠。② 關節液采集：取1 mL注射器1支，抽取超純水0.1 mL，經髕上囊注入右膝關節腔，充分屈伸活動膝關節；再以l mL注射器再次抽取超純水0.2 mL，沿髕骨上緣小切口打開關節囊，經切口輕輕灌洗，回抽數次后，充分抽回關節液里的稀釋液，轉移至EP管，離心機3 000 rmp離心20 min，取上清液，置入液氮箱冷凍保存，再轉移至-80℃冰箱凍存。③剝離周圍肌肉筋膜組織后，取左側膝關節固定于4%多聚甲醛，行組織形態學觀察。

2.3 檢測指標

2.3.1 左側膝關節HE染色 將雌性大鼠左側膝關節取下，用4%多聚甲醛固定48 h后續用備制好的脫鈣液（10%EDTA）脫鈣6周。再以針灸針穿刺膝關節及股骨、脛骨等標本，針刺無明顯阻力時即可確定為脫鈣成功。脫鈣成功后，石蠟包埋組織并切片（6 μm），以蘇木素-伊紅（HE）染色，采用生物倒置顯微鏡觀察對比3組形態學改變。對其組織結構、細胞形態及潮線的完整性進行膝關節軟骨的Mankin 評分及分級［8］：0～2 分為正常軟骨，3～5 分為軟骨表面纖維化，6～7分為中度軟骨損傷，8～10為重度軟骨損傷，10分以上為軟骨完全缺失。

2.3.2 膝關節MMP-13表達 免疫組化檢測標本制備：膝關節石蠟包埋組織并切片（4 μm）后，常規脫蠟至水。以緩沖液洗3 min 2次，降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，再滴加一抗工作液，37℃孵育1～2 h。緩沖液洗 5 min 2次，滴加Primary Antibody Enhancer，在室溫下孵育20 min。緩沖液洗 5 min 2次，滴加 HRP Polymer（酶標二抗）后以自來水充分沖洗、蘇木素復染、脫水、透明直至封片。并以DMI 6000+型生物倒置顯微鏡觀察MMP-13的表達情況，采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件，分析高倍鏡下（10×40倍）拍攝的圖片并選定單位面積，進行圖標定量分析。

2.3.3 血清E2濃度 3組雌性大鼠腹主動脈血充分解凍后，采用酶聯免疫競爭法，檢測血清中E2濃度。

2.3.4 膝關節液中TNF-α的濃度 關節液充分解凍后，離心機以3 000 rmp，再次離心20 min，吸取上清液，采用酶聯免疫競爭法，檢測右膝關節液中TNF-α的濃度。

2.4 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布，以（x±s）表示，采用t檢驗。

3 結 果

3.1 HE染色 對照組軟骨中的基質染色均勻，潮線清晰可見，軟骨中層細胞無簇集現象且排列整齊，軟骨表層光滑無損；去卵巢組軟骨表層粗糙，細胞簇集及明顯凋亡缺失，潮線變得模糊，軟骨基質染色改變；去卵巢+跑步組軟骨表層粗糙、皺褶及裂隙，細胞仍有缺失，潮線模糊，軟骨基質染色改變，中層細胞開始不同程度地增殖。見圖1。

圖1 3組大鼠左膝關節軟骨HE染色圖（×200）

3.2 3組大鼠膝關節軟骨Mankin評分比較 見表1。

表1 3組大鼠膝關節軟骨Mankin評分比較（x±s） 分

3.3 3組大鼠膝關節MMP-13免疫組化情況比較免疫組化SP技術DAB顯色結果：陰性片無表達；對照組MMP-13表達較少；去卵巢組MMP-13表達量增加；去卵巢＋跑步組MMP-13表達量最為顯著。見圖 2、表 2。

圖2 3組大鼠膝關節MMP-13表達免疫組化圖（×400）

表2 3組大鼠膝關節MMP-13陽性目標積分光密度值比較（x±s）

3.4 3組大鼠血清中E2、膝關節液TNF-α濃度比較 見表3。

表 3 3組大鼠血清中E2、膝關節液 TNF-α 濃度比較（x±s）pg／mL

4 討論

絕經后女性骨關節炎的患病率較高，因雌激素的下降可作用于軟骨中的炎癥因子，參與軟骨細胞代謝、基質合成及分解，與女性膝骨關節炎產生關聯［6，10］。 研究 絕經后膝骨 關節炎的生理、病理關系中，選用動物模擬模型做實驗是較安全的方法。動物造模方法較多［6］，本實驗選擇了不受任何外界干預而產生膝關節病變的模型［11］進行研究探討E2、MMP-13、TNF-α 的相關性。

本實驗結果顯示：與對照組比較，去卵巢組和去卵巢＋跑步組Mankin評分、膝關節MMP-13表達、關節液TNF-α濃度均明顯提高（P＜0.01），血清E2濃度明顯降低（P＜0.01），且以去卵巢＋跑步組變化最為顯著。由此可見，膝關節軟骨嚴重缺損時Mankin評分越高，而血清E2水平則越低，提示E2水平檢測結果與Mankin評分兩者存在負相關性，E2水平的下降與膝關節軟骨損傷及炎癥的發生具有共同的發病機理，且存在一定的相關性［12-13］。E2可抑制TNF-α炎性因子的釋放，從而減少炎癥的發生［14-15］，E2下降則 TNF-α 的濃度升高。 MMP-13是近年來學者研究膝骨關節炎發病機制的重要指標之一，其在膝骨關節炎軟骨細胞中存在高表達，是關節軟骨退變的主要因素，MMP-13表達的增減與其受損的程度密切相關［16-17］。本實驗中去卵巢＋跑步組也存在MMP-13在關節軟骨中存在持續高表達狀態［18］，證明 E2與MMP-13均參與了關節軟骨的完整性、炎癥的發生及其退變的過程，提示了雌激素和軟骨退化具有一定的相關性，這為絕經老年女性膝關節炎發病的研究提供了實驗數據和依據。

參考文獻：

［1］ 陳賽楠，黃云梅，陳文列，等.透骨消痛膠囊干預兔膝骨關節炎蛋白多糖與MMP-2、MMP-13表達的實驗研究［J］.風濕病與關節炎，2015，4（7）：5-10，60.

［2］ 李芃，張俐.張俐教授治療中老年女性膝骨關節炎經驗［J］.風濕病與關節炎，2014，3（3）：40-42，51.

［3］ 王文勝，陳偉，沈保磊，等.強骨寶對去勢大鼠原發性膝骨關節炎關節軟骨影響的實驗研究［J］.風濕病與關節炎，2016，5（4）：10-13.

［4］ 宋素艷，張曉玲.小針刀療法治療膝骨性關節炎療效觀察［J］.陜西中醫，2012，33（8）：1071，1100.

［5］ 葛均波，徐永健.內科學［M］.北京：人民衛生出版社，2013：852-854.

［6］ 張俐，李芃，陳凱.去勢大鼠勞損性膝骨關節炎新模型的建立［J］.中國中醫骨傷科雜志，2014，22（11）：1-3.

［7］ 李芃.強骨寶對疲勞性損傷誘發去勢大鼠膝骨關節炎的作用及機制［D］.福州：福建中醫藥大學，2015.

［8］ MANKIN H J，DORFMAN H，LIPPIELLO L，et al.Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteoarthritic human hips.II.Correlation of morphology with biochemical and metabolic data ［J］.J Bone Joint Surg Am，1971，53（3）：523-537.

［9］ 郭欣宇，馬英，曾艷，等.絕經期骨性關節炎患者血漿性激素和細胞因子水平及其與膝關節功能的相關性［J］.中國全科醫學，2008，11（10）：852-854.

［10］王鳳翔，董桂芳，王素杰，等.雌激素與絕經后膝骨性關節炎相關分析［J］.慢性病學雜志，2010，12（8）：863，865.

［11］魏星臨，劉建宇.上坡運動對去卵巢骨質疏松大鼠股骨及椎體骨密度的影響［J］. 中國老年學雜志，2015，35（15）：4163-4164.

［12］周君，何成奇，郭華，等.兔膝骨關節炎合并骨質疏松癥動物模型的建立［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2011，41（15）：7639-7642.

［13］秦杏坤，柳慶坤，薛會茹，等.亞硫酸鹽和雌激素及炎癥因子在老年女性膝骨關節炎血清與關節液中的水平及意義［J］.河北醫藥，2012，34（6）：822-825.

［14］ GANESAN K，TIWARI M，BALACHANDRAN C，et al.Estrogen and testosterone attenuate extracellular matrix loss in collageninduced arthritis in rats ［J］.Calcif TissueInt，2008，83（5）：354-364.

［15］ TINTI L，NICCOLINI S，LAMBOGLIA A，et al.Raloxifene protects cultured human chondrocytes from IL-1β induced damage：a biochemical and morphological study ［J］.Eur J Pharmacol，2011，670（1）：67-73.

［16］ 張超，王旭，姜建元，等.MMP-1、13 mRNA和DDR2表達與關節軟骨退變的關系［J］. 復旦學報（醫學版），2007，34（1）：126-128.

［17］周君，郭華，夏璐，等.去卵巢對兔膝關節軟骨及基質金屬蛋白酶-13 表達的影響［J］.中國老年學雜志，2012，32（19）：4235-4237.

［18］唐浚洲，蘇楠，周思儒，等.手術誘導的小鼠骨關節炎模型中關節軟骨MMP-13表達上調［J］.第三軍醫大學學報，2014，36（9）：919-922.