敗醬草抑制大腸癌HCT-8／5-FU細胞耐藥的作用研究

周 莊 ，劉望予 ，婁云云 ，湯錦周 ，王建榮 ，陳錦緞

（1.福州市第二醫(yī)院，福建 福州 350007；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

大腸癌發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢，每年新增病例高達120萬，死亡病例也遠超60萬人［1－2］。 化療是大腸癌晚期患者、轉(zhuǎn)移性患者等不適合手術(shù)患者的主要治療方式［3］，5-氟尿嘧啶（5-FU）是大腸癌化療的基礎用藥［4］，廣泛應用于大腸癌治療。然而，耐藥的產(chǎn)生和毒副作用的存在是影響其臨床療效并最終導致治療失敗的主要原因［5］。因此，抑制耐藥性將有助于提高化療藥物療效和降低化療藥物使用濃度，從而降低化療導致的毒副作用。

大腸癌屬中醫(yī)“腸癖”“腸覃”范疇，以“濕熱蘊毒下迫大腸、熱傷腸絡、毒邪成癰”為主要病機，“清熱解毒、消癰散結(jié)”是其治法治則之一［6－7］。 敗醬草屬敗醬科植物黃花敗醬、白花敗醬的干燥全草，具有清熱解毒、祛瘀止痛、消癰排膿的功效，符合大腸癌“清熱解毒、消癰散結(jié)”治法治則［8－9］，已有研究報道，敗醬草在臨床中廣泛應用于大腸癌等惡性腫瘤的治療，且療效確切［10］。基礎研究也證實了敗醬草具有顯著抑制大腸癌細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制血管新生以及抑制炎癥相關因子的作用［11-15］。然而，對大腸癌治療藥物5-FU耐藥的影響尚未見報道，因此，本課題探討了敗醬草對5-FU耐藥性的影響。

1 材料

1.1 細胞株和藥物 人源性腸癌細胞株HCT-8和耐5-FU的HCT-8／5-FU細胞株均購于江蘇南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；敗醬草全草購于福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂。

1.2 試劑 胎牛血清（FBS）、RPMI 1640空白培養(yǎng)基、含 EDTA（0.25%）的胰蛋白酶（美國 GBICO公司）；PBS、青霉素-鏈霉素（美國 Hyclone公司）；結(jié)晶紫、MTT（美國 Amresco公司）；5-FU粉末、阿霉素（美國Sigma公司）。

1.3 儀器 細胞培養(yǎng)工作臺（蘇州凈化設備公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；離心機（德國Eppendorf公司）；全自動酶標儀（美國Bio－Tek公司）；熒光倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國徠卡公司）。

2 方 法

2.1 藥物配制 敗醬草全草500 g溶入4 000 mL 80%乙醇中，加熱回流提取2次，每次30 min，提取液過濾，濾液減壓濃縮（50℃，0.01MPa）至相對密度1.05，噴霧干燥（進出口溫度為 140℃／80℃）得干粉［16］；稱量適量提取物，用 50%DMSO 和 50%PBS溶解，配制成 250 mg／mL的儲存溶液，經(jīng)震蕩和超聲后，-20℃分裝保存?zhèn)溆茫皇褂们爸檬覝鼗謴停肦PMI 1640完全培養(yǎng)基稀釋成所需的濃度并過濾，并用 DMSO 補齊［16］。

2.2 5-FU溶液配制 采用DMSO溶解適量的5-FU粉末，并配制成1M的存儲液，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r采用倍比稀釋法將5-FU儲存液用完全培養(yǎng)基配制成所需的使用濃度，用于細胞干預。

2.3 細胞培養(yǎng) 將細胞置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細胞覆蓋率達80%～90%時，用含EDTA的胰酶消化（每瓶加入0.8 mL胰酶，消化2～3 min）；待細胞消化下來后，加入2～3倍體積的新鮮完全培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基含10%FBS、100 U／mL青霉素和100 μg／mL 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液）中和，將上述細胞懸液轉(zhuǎn)移到15 mL的離心管中離心（1 000 轉(zhuǎn) ／min，3～5 min）；離心結(jié)束后，棄上清，并加入5 mL新鮮培養(yǎng)基，重懸、計數(shù)，用于后續(xù)的接種、傳代。HCT-8細胞用RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，HCT-8／5-FU 用含 15 μg／mL RPMI 1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，實驗前改用不含5-FU的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.4 倒置顯微鏡觀察細胞生長 HCT-8和HCT-8／5-FU 分別按 2×105／mL接種于 6孔板中（2 mL／孔），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，并給予不同濃度的5-FU 干預（0～200 μM）或敗醬草干預（0～2 mg／mL）。藥物干預24 h后通過倒置顯微鏡（×200）觀察細胞生長。

2.5 MTT法檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的HCT-8／5-FU細胞及其親本細胞HCT-8，分別接種于96孔板（100 μL ／孔，0.8×105／mL）；細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，分別加入終濃度為 0、50、100和200 μM 5-FU 溶液 （HCT-8／5-FU 細胞和 HCT-8細胞）或 0、0.5、1、2 mg／mL 敗醬草溶液（HCT-8／5-FU細胞）干預24 h，每個劑量各3各復孔。實驗結(jié)束后，棄上清液，每孔加入 MTT 溶液（100 μL／孔，0.5 mg／mL）并在培養(yǎng)箱中避光孵育4 h；孵育結(jié)束后，棄 MTT 溶液，并加入 DMSO（100 μL／孔）溶解，采用全自動酶標儀（波長為570 nm）測定OD值，并根據(jù)OD值計算細胞的活力。以對照組細胞活力為100%，實驗組的細胞活力＝實驗組OD值／對照組OD值×100%。

2.6 熒光倒置顯微鏡觀察阿霉素（ADM）蓄積情況取對數(shù)生長期HCT-8／5-FU細胞接種于6孔板（1×105／mL，2 mL／孔），細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后，分別給予不同濃度的敗醬草溶液（0～2 mg／mL）干預24 h。實驗結(jié)束后，棄上清，PBS清洗3遍，加入適量的阿霉素染色溶液（5 μM，1 mL／孔），培養(yǎng)箱避光孵育后，用預冷的PBS清洗3遍，用熒光倒置顯微鏡觀察拍照（×200）。

2.7 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料屬正態(tài)分布的以（x±s）表示，2組數(shù)據(jù)和多組數(shù)據(jù)分別采用獨立樣本t檢驗和多因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 HCT-8／5-FU細胞株對5-FU具有耐藥性驗證 HCT-8和HCT-8／5-FU細胞分別經(jīng)不同濃度5-FU（0、50、100、200 μmol／L）干預后，倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)HCT-8細胞數(shù)目逐漸減少，部分細胞出現(xiàn)皺縮、變圓和漂浮等現(xiàn)象，而HCT-8／5-FU細胞未見明顯細胞形態(tài)和細胞數(shù)量改變，可見其具有一定的耐藥性（圖1A）。這一現(xiàn)象進一步通過MTT實驗進行驗證，MTT檢測結(jié)果如圖1B所示：HCT-8細胞經(jīng)不同濃度5-FU干預后，細胞活力顯著降低；而HCT-8／5-FU細胞在不同濃度5-FU干預后，細胞活力下降不明顯；在相同濃度5-FU干預下，HCT-8的細胞活力顯著低于HCT-8／5-FU細胞。進一步證實了HCT-8／5-FU細胞對5-FU具有一定的耐藥性。

圖1 HCT-8／5-FU細胞耐藥性驗證圖（×200）

3.2 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞生長的影響 倒置顯微鏡的觀察結(jié)果如圖2所示：不同濃度敗醬草（0.5～2 mg／mL）干預后，HCT-8／5-FU 細胞覆蓋率明顯降低，可見部分細胞變小、變圓，提示敗醬草對HCT-8／5-FU細胞的生長有一定的抑制作用。

3.3 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞活力的影響 如圖3所示：用不同濃度的敗醬草溶液干預24 h，HCT-8／5-FU細胞株細胞活力明顯降低，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；且濃度越高，細胞活力越低。實驗結(jié)果進一步證實了敗醬草對HCT-8／5-FU細胞生長的抑制作用。

圖2 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞形態(tài)的影響（×200）

3.4 敗醬草溶液對HCT-8／5-FU細胞阿霉素蓄積的影響 阿霉素具有自帶熒光的特性，阿霉素在細胞內(nèi)的熒光強度可以反映其在細胞內(nèi)的濃度從而反映細胞膜的外排功能。本研究采用阿霉素染色和倒置熒光顯微鏡觀察不同濃度敗醬草干預對阿霉素蓄積的影響。如圖4所示：與對照組比較（熒光較弱），不同濃度敗醬草溶液（0.5～2 mg／mL）干預后，可顯著增加阿霉素（紅色熒光）在HCT-8／5-FU細胞株細胞內(nèi)的蓄積。結(jié)果提示敗醬草具有抑制HCT-8／5-FU細胞膜藥物外排的作用。

圖3 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞活力的影響

圖4 敗醬草對HCT-8／5-FU細胞阿霉素蓄積的影響（×200）

4 討論

5-FU是大腸癌化療基礎用藥，在體內(nèi)會轉(zhuǎn)化成氟尿嘧啶核苷酸，具有抑制DNA、RNA合成的作用［17］，臨床上廣泛應用于消化系統(tǒng)腫瘤的治療［4］。然而化療過程產(chǎn)生耐藥是影響化療療效和最終導致治療失敗的最主要原因。腫瘤化療導致的耐藥機制極其復雜，其中ABC家族蛋白高表達介導的細胞膜的外排功能異常增強和細胞凋亡增殖蛋白異常表達介導的凋亡抵抗是腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥功能的主要機制之一［18］，因此，抑制腫瘤細胞生長和藥物外排功能是抑制耐藥的重要途徑之一。

中藥治療惡性腫瘤的歷史悠久，療效可佳，而且相對化療藥物，具有毒副作用較小和作用靶點多等特點。基礎研究已證實敗醬草具有顯著抑制大腸癌細胞增殖、誘導細胞凋亡和抑制血管新生的作用［10-12］。本研究進一步研究了敗醬草具有顯著抑制HCT-8／5-FU細胞的作用，同時也初步證實了敗醬草干預能夠抑制HCT-8／5-FU細胞的外排功能。可見，敗醬草對大腸癌耐藥具有一定的抑制作用。

大腸癌耐藥的發(fā)生發(fā)展過程極為復雜，其發(fā)生機制與多條信號轉(zhuǎn)導通路的異常調(diào)控密切相關，而敗醬草治療大腸癌具有多成分、多靶點的作用特點。本研究僅從細胞層面觀察敗醬草對于大腸癌耐藥的影響，敗醬草對于大腸癌耐藥細胞的調(diào)控作用及復雜機制的研究仍有待進一步深入。

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