九節(jié)茶浸膏分離富集前后成分對比研究

歐余航，吳文杰

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；2.廈門消防支隊(duì)后勤處衛(wèi)生隊(duì)，福建 廈門 361000）

九節(jié)茶系金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai的干燥地上部分（腫節(jié)風(fēng)為其全草［1］），夏、秋兩季采收，除去雜質(zhì)，曬干，以江西、福建的草珊瑚自然分布中心區(qū)質(zhì)量較佳［2］，是福建省道地優(yōu)質(zhì)藥材品種之一，具有消炎鎮(zhèn)痛等作用。本實(shí)驗(yàn)以九節(jié)茶浸膏為原料，擬研究開發(fā)外用新藥—九節(jié)茶腫痛寧乳膏，利用高效液相色譜分離能力強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，對九節(jié)茶浸膏過柱前后成分變化及含量進(jìn)行了對比分析，為新藥制劑研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

有研究表明：中藥中有效成分不是單一的某一成分或者是某一類成分，因此僅某一成分或某兩成分的定量考察，不能反應(yīng)出藥物的整體水平。因此建立一個(gè)有效方法對九節(jié)茶浸膏分離富集有效部位前后的成分進(jìn)行對比分析，以此來對分離富集后的產(chǎn)品做出更全面、準(zhǔn)確評價(jià)十分重要。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 WatersE2695SeparetiongsModμLeHPLC系統(tǒng)［（沃特世科技（上海）有限公司）］；METTLER AE240天平［（梅特勒-托利多（上海）有限公司）］；BFX5-320型低速離心機(jī)（河北白洋離心機(jī)廠）；SB4200DT數(shù)控超聲波清洗器（上海珂淮儀器有限公司）。

1.2 試藥 HPD-400型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；迷迭香酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111871-201001）；九節(jié)茶浸膏由三明華健生物工程有限公司參照《中華人民共和國藥典（一部）》［1］腫節(jié)風(fēng)浸膏制法工藝生產(chǎn)提供，批號：20100301；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；液相用水為超純水；樹脂相關(guān)用水為蒸餾水。

2 方 法

2.1 供試品溶液的制備 稱取九節(jié)茶浸膏30 g，加水300 mL，攪拌，超聲溶解，以4 000 rpm／min離心15 min，取上清液備用。精密量取上清液1 mL，置10 mL量瓶，加30%乙醇定容至刻度。

取上述九節(jié)茶浸膏上清液適量，經(jīng)HPD-400型大孔吸附樹脂進(jìn)行分離富集，上樣體積與樹脂體積比為4∶1，水洗1BV，再用70%乙醇洗脫體積3BV，收集該部位洗脫液；將洗脫液濃縮至密度約為1.07 g／mL的清膏，精密量取該清膏2 mL，置100 mL量瓶，加30%乙醇定容至刻度。

2.2 色譜條件 色譜柱：HypersiL ODS （4.6 μm×250 mm，5 μm）；柱溫：30℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1 mL／min；流動(dòng)相：A 為乙腈（含0.1%的甲酸），B為0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脫：0～25 min，5%～36.5%A；25～30 min，36.5%～36.5%A；30～31 min，36.5%～5%A；31～35 min，5%～5%A。

2.3 方法學(xué)考察 為了考察分析方法的可靠性，以色譜圖中峰面積最大的特征峰為參比峰（S），其色譜峰的保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算其它各峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積比值。依照2.2項(xiàng)下的方法和條件測定，得九節(jié)茶浸膏分離富集后清膏的圖譜，根據(jù)得到的峰數(shù)、峰值（積分值）、峰位（保留時(shí)間）等相關(guān)參數(shù)，共標(biāo)示出 16個(gè)共有特征峰。從指紋圖譜中可以看出16號峰（保留時(shí)間20.598 min）峰形好、純度高，故選其作為參照峰，如圖1。

2.3.1 精密度考察 取經(jīng)樹脂分離富集后的清膏供試品溶液，按2.2項(xiàng)下的方法，連續(xù)進(jìn)樣 6次，各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均在2%之內(nèi)，相對峰面積RSD均在2%之內(nèi)，證明本法精密度良好。

圖1 樣品HPLC圖譜

2.3.2 重現(xiàn)性考察 按2.1項(xiàng)下的方法，制備經(jīng)樹脂分離富集后的清膏供試品溶液6份，按2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明：各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均在2%之內(nèi)，相對峰面積RSD均在2%之內(nèi)，證明本法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察 按2.1項(xiàng)下的方法，新制經(jīng)樹脂分離富集后的清膏供試品溶液1份，按2.2項(xiàng)下的方法分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測定。 結(jié)果表明：各共有峰的相對保留時(shí)間RSD均在2%之內(nèi)，相對峰面積RSD均在2%之內(nèi)，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，證明本法穩(wěn)定性良好。

3 九節(jié)茶浸膏分離富集前后圖譜成分比較

取九節(jié)茶浸膏 4 批（20110706、20110707、2012 0319、20120320），按2.1項(xiàng)下的方法制成4份供試品，按照2.2項(xiàng)下的方法，取九節(jié)茶浸膏分離富集前及分離富集后4份樣品分別進(jìn)樣。采用中國藥典委員會(huì)“中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A）”軟件，對九節(jié)茶浸膏分離富集前后樣品的色譜峰進(jìn)行整體相似性評價(jià)。通過中藥指紋圖譜相似度軟件得出4份九節(jié)茶浸膏分離富集后色譜峰與九節(jié)茶浸膏的的相似度為分別為 0.830、0.868、0.866、0.872，九節(jié)茶浸膏與共有模式的相似度為0.942，分離富集后的4份樣品與共有模式的相似度分別為0.963、0.982、0.981、0.975。

如圖2所示：通過上述相似度評價(jià)軟件分析，經(jīng)分離富集后的清膏各成分基本一致，表明分離富集的方法重復(fù)性良好；同時(shí)與九節(jié)茶浸膏比較，成分也較為相近，化學(xué)成分基本相同。相對于分離富集的的清膏，九節(jié)茶浸膏在0～6 min內(nèi)極性較大的成分在分離富集過程中被除去，其他成分均得到保留和富集。

圖2 九節(jié)茶浸膏分離富集前后色譜圖

4 討論

九節(jié)茶浸膏以九節(jié)茶為原料，九節(jié)茶原藥材因地域、氣候及采收時(shí)間等因素的影響，實(shí)際使用時(shí)不能保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定。同樣經(jīng)分離富集得到的中間體，每個(gè)批次在成分含量、成分組成及各成分比例方面都不能保持完全的一致。因此通過該成分研究，可以對九節(jié)茶浸膏分離富集后產(chǎn)物的成分進(jìn)行監(jiān)控。通過控制中間體的穩(wěn)定性，從而保證成品在成分含量、組成比例上一致，減少批間差異。

相對于分離富集的的清膏，九節(jié)茶浸膏在0～6 min內(nèi)極性較大的成分在分離富集過程中被除去，其他成分均得到保留和富集。根據(jù)后期藥效學(xué)數(shù)據(jù)［3］可以看出：分離富集后的清膏仍有良好的消炎鎮(zhèn)痛的作用，因此推測這些極性較小的成分為其消炎鎮(zhèn)痛的主要成分。

《中藥辭海》記載：“腫節(jié)風(fēng)浸膏有消腫散結(jié)，清熱解毒之功效”，現(xiàn)代廣泛用于消炎止痛藥、潤喉含片、血熱紫斑紫癜藥，如清熱消炎寧膠囊（片劑）、腫節(jié)風(fēng)注射液、血康口服液、腫節(jié)風(fēng)片、復(fù)方草珊瑚含片、新癀片、萬通炎康片、消炎靈片、三蛇膽川貝液、抗癌平丸和跌打傷科酒等［4-8］，此外，在保健品領(lǐng)域也有涉及，如草珊瑚牙膏［9］。本課題所涉及的擬研發(fā)新藥“九節(jié)茶腫痛寧乳膏”，方中九節(jié)茶味辛、苦，功專清熱解毒，活血散瘀通絡(luò)，為君藥；配以冰片清熱消腫止痛［10-11］，又能促透皮吸收［12-13］。 二藥合用，共奏“活血化瘀、消腫止痛”之功，可用于治療關(guān)節(jié)扭傷、肌肉拉傷、韌帶損傷等急性軟組織損傷。由此可見，九節(jié)茶的開發(fā)前景巨大，以期此實(shí)驗(yàn)研究對其相關(guān)中藥制劑提供數(shù)據(jù)支持。

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