白藜蘆醇緩解高脂飼喂小鼠的胰島素抵抗與調控肝臟線粒體功能作用研究

王翠雪，王 麗，錢偉倫，于志文，王英豪

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

胰島素抵抗是肥胖、代謝綜合征和2型糖尿病等疾病的基礎機理，又與線粒體功能的損害密不可分［1］。而線粒體功能與線粒體分裂和融合的形態和功能改變密切關聯，當線粒體功能損害時，一方面造成能量代謝紊亂，另一方面通過產生過氧化物并激活炎癥等信號途徑產生對胰島素信號的負反饋調節等，從而進一步誘發或加重胰島素抵抗和糖尿病等疾病的發生發展。

白藜蘆醇是一種存在于虎杖、藜蘆、花生、葡萄等天然植物的多酚化合物。十年多來的大量研究證實：白藜蘆醇具有明確的改善胰島素抵抗作用［2］。然而，白藜蘆醇的藥效機理尚未完全闡明，尤其是其對線粒體功能的調節作用與胰島素抵抗的相關研究尚很不足。本研究通過高脂誘導小鼠胰島素抵抗模型，用白藜蘆醇藥物灌胃進行短期干預后，檢查與肝臟線粒體調控相關的信號蛋白表達和線粒體功能等生化指標，以及肝臟炎癥信號關鍵蛋白的表達，探討白藜蘆醇是否可能通過調節線粒體功能和炎癥，起到改善胰島素抵抗的藥效作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與試劑 8周齡SPF級雄性C57BL／6J小鼠（許可證號：SCXK滬2013-0018）；低脂飼料（4.5%脂肪）、高脂飼料（45%脂肪）均購自廣州省醫學實驗動物中心；白藜蘆醇（成都曼斯特生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP 酶測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；ECL顯影液（北京康為世紀生物科技公司）；IKBα、TNF-α、Mfn2、OPA1、Drp1 抗體（美國 Cell Signaling公司）；GAPDH抗體（美國Santa Crue公司）。

1.2 實驗儀器和材料Trans-Blot小型電泳及轉印槽、轉模儀（美國Bio-Rad公司）；血糖儀和血糖試紙（上海魚躍醫療設備有限公司）；ChemiDocXRS化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 實驗方法

2.1 胰島素抵抗模型的建立及藥物干預 8周齡SPF級雄性C57BL／6J小鼠30只，隨機分為低脂對照組（n＝10）、高脂模型組（n＝20），分別用低脂飼料（4.5%脂肪）和高脂飼料（45%脂肪）喂養。飼喂12周后，通過葡萄糖耐量實驗（IPGTT）檢測胰島素抵抗模型是否成功建立。再將成功的胰島素抵抗模型小鼠隨機分為模型組（n＝10）、藥物組（n＝10）。 藥物組給予白藜蘆醇50 mg／kg劑量每天灌胃1次，而對照組和模型組按體重給予等量生理鹽水每天灌胃1次，連續干預10 d。

2.2 血糖測定 3組小鼠連續干預10 d后，禁食12 h，取小鼠尾椎靜脈血檢測空腹血糖。然后每只小鼠腹腔注射 1.5 g／kg葡萄糖，分別于 15、30、60 min和120 min尾椎靜脈取血測定血糖。

2.3 組織蛋白樣品制備 3組小鼠禁食12 h后，脊椎脫臼處死，迅速取出小鼠肝臟，放入液氮速凍5 min，置于-80℃冰箱儲存。取50 mg肝臟組織，加入預冷的細胞蛋白裂解液，在冰上用組織研磨器勻漿，放入離心機內14 000 rpm，4℃離心10 min，取上清。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，制備蛋白樣品。

2.4 免疫蛋白印跡（Western Blot） 蛋白樣品經聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉于硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶 TBST 室溫封閉 2 h，一抗（1∶1000） 4℃孵育過夜，二抗（1∶2000）稀釋室溫反應 2 h，洗脫劑TBST洗滌4次，用ECL顯影曝光并記錄。

2.5 Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP-pase 含量測定 稱取小鼠肝臟組織 30 mg，按重量 ／g∶體積 ／mL＝1∶9 的比例，加入生理鹽水，冰上組織研磨器勻漿，3 000轉／min，離心10 min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。 根據 Na＋K＋、Ca＋＋Mg＋＋-ATP 酶測試盒說明書操作。

2.6 統計學方法 數據使用軟件SPSS20.0統計分析。計量資料屬正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗。

3 實驗結果與分析

3.1 白藜蘆醇緩解高脂誘導胰島素抵抗的糖耐量異常 高脂飼料喂養12周后，模型組小鼠糖耐量明顯損害，見圖1；白藜蘆醇藥物干預10 d后，藥物組小鼠血糖明顯低于模型組，見圖2。白藜蘆醇明顯改善高脂誘導的胰島素抵抗。

圖1 高脂飼料造模12周后糖耐量實驗結果圖

圖2 白藜蘆醇緩解胰島素抵抗小鼠糖耐量異常

3.2 白藜蘆醇抑制高脂造成的肝臟線粒體形態調控蛋白和功能異常 在小鼠肝臟組織中，白藜蘆醇促進線粒體融合蛋白 Mitof Usin2（Mfn2）、Optic Atroploy1（OPA1）表達，抑制線粒體促分裂蛋白Dyaminrelated Protein1（Drp1）的表達，見圖3。模型組與對照組比較，模型組小鼠肝臟中 Ca＋＋Mg＋＋、Na＋K＋ATP-pase含量明顯降低，而藥物組可以明顯逆轉這一現象，增加 Ca＋＋Mg＋＋、Na＋K＋ATP-pase含量。見圖4～5。

圖3 3組小鼠肝臟線粒體形態調控蛋白信號變化圖

圖4 3組小鼠肝臟線粒體調控蛋白密度統計圖

圖5 3組小鼠肝臟ATP酶活性含量圖

3.3 白藜蘆醇明顯抑制肝臟的炎癥信號及相關因子 白藜蘆醇可以明顯增加小鼠肝臟組織中NF-kB的抑制性蛋白IκBα的表達，相應地減少腫瘤壞死因子（TNF-α）蛋白的表達。見圖6～7。

圖6 3組小鼠肝臟炎癥信號蛋白變化圖

4 討 論

圖7 3組小鼠肝臟炎癥信號蛋白密度統計圖

線粒體作為能量代謝的最重要細胞器，近年相關研究的重要進展之一是線粒體分裂和融合的線粒體形態變化與線粒體功能密切相關。前期研究證實線粒體調控的幾種關鍵蛋白，即Mitofusin 1（Mfn1）、Mfn2和OPA1在高脂模型小鼠肝臟均受到抑制［3］，相反，線粒體促分裂蛋白 Drp1明顯升高，這一結果與已有的報告結果一致［4］，并提示在高脂胰島素抵抗情況下，抑制了線粒體融合。本研究進一步表明：白藜蘆醇短期干預則可明顯緩解和逆轉高脂造成的這些線粒體調控蛋白的異常，線粒體ATP-pase的檢測結果也支持白藜蘆醇干預可以緩解高脂飼喂造成的小鼠肝臟線粒體功能障礙。

在線粒體功能障礙時，一方面其正常產能作用損害，另一方面線粒體產生的過氧化物增加［5］，線粒體可以改變氧化還原平衡狀態，激活炎性信號蛋白［6］。另外，線粒體與NF-κB炎性信號通路之間也有密切的對話，通過激活炎癥起到抑制胰島素信號傳導和功能作用［7］。本研究證實，白藜蘆醇可以抑制高脂造成的 IκBα降低并抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）炎性因子的表達。

參考文獻：

［1］ 時麗麗，張莉，譚初兵，等.線粒體功能損傷與胰島素抵抗［J］.中國藥理學通報，2012，28（11）：1481-1486.

［2］ 陳莉，陳冠軍，陳兵，等.白藜蘆醇改善高脂血癥小鼠脂肪組織胰島素抵抗的機制探討［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（8）：1104-1109.

［3］ LIU K，ZHOU R，WANG B，et al.Effect of resveratrol on glucose control and insulin sensitivity：a meta-analysis of 11 randomized controlled trials ［J］.American Journal of Clinical Nutrition，2014，99（6）：1510-1519.

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［5］ LANG A，ANAND R，ALTINOLUKHAMBUCHEN S，et al.SIRT4 interacts with OPA1 and regulates mitochondrial quality control and mitophagy ［J］.Aging，2017，9（10）：2163.

［6］ ASADI S，MORADI M N，KHYRIPOUR N，et al.Resveratrol Attenuates Copper and Zinc Homeostasis and Ameliorates Oxidative Stress in Type 2 Diabetic Rats ［J］.Biological Trace Element Research，2017，177（1）：132-138.

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