福林酚法測定閩產鹽膚木根莖中總酚酸的含量

葉永華 ，張 雙 ，游立群 ，江穎倩 ，許 文 ，2，葉 淼 ，2，徐 偉 ，2*

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學生物醫藥研發中心，福建 福州 350122）

鹽膚木Rhus chinensis Mill.為漆樹科鹽膚木屬落葉小喬木［1］，據《開寶本草》記載鹽膚木根莖功能利水消腫、活血散瘀、行氣止痛［2］。現代藥理學研究表明：鹽膚木根莖具有改善冠狀動脈循環和血液流變性的作用［3］。其有效成分為酚酸、鞣質、黃酮、三萜及這幾大類型化合物的苷類［2］，酚酸是一類結構復雜的多元酚化合物，它是鹽膚木的主要成分，也是其主要的藥效物質基礎［3］。用紫外分光光度法測定中藥中的酚酸、黃酮含量［4，5］比較常見，而目前未見鹽膚木根莖質量評價報道，因此本研究建立鹽膚木根莖中總酚酸含量的測定方法，為鹽膚木質量標準奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1800型可見分光光度計（日本島津公司）；Sartorius CPA225D十萬分之一天平［賽多利斯（上海）科學儀器有限公司］；IKA RV10型旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；SHB-III型循環水多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；LX-07A型多功能粉碎機（上海江信科技有限公司）；HH-Z型數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器公司）。

1.2 試藥 鹽膚木產于福建，鹽膚木根莖于2015年12月20日購自安徽協和成藥業飲片有限公司，批號15122201，經福建中醫藥大學范世明高級實驗師鑒定為鹽膚木根莖Rhus chinensis Mill.，樣品均采用自然陰干的方法干燥。沒食子酸對照品（純度≥98.0%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201204）；碳酸鈉、磷鉬鎢酸試劑、乙醇等試劑均為分析純；實驗用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱定沒食子酸25 mg放置于50 mL棕色量瓶中，加適量水超聲溶解，稀釋至刻度，搖勻；再從中精密移取5 mL至25 mL量瓶并加水定容，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液制備 取切成塊的鹽膚木根莖，粉碎，過40目篩，取粉末0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，加入10倍量60%乙醇，精密稱定；水浴回流提取1.5 h，精密稱定，用60%乙醇補足減失重量，濾過，即得。

2.3 總酚酸含量測定

2.3.1 總酚酸顯色方法及波長測定 依據參考文獻［6］測定總酚酸的方法，分別精密移取沒食子酸對照品溶液、供試品溶液1 mL，分別置25 mL棕色量瓶中，再加水至12 mL，按照下述總酚顯色方法顯色：加入磷鉬鎢酸試劑1 mL，最后用29%碳酸鈉溶液定容，搖勻后在30℃水中保溫35 min；再將供試品以及對照品顯色溶液分別以同樣處理的空白顯色體系為空白對照，在400～800 nm波長處進行掃描，它們的最大吸收波長都在760 nm左右，因此將760 nm作為總酚酸含量測定波長。如圖1所示。

圖1 鹽膚木中總酚酸全波長掃描圖

2.3.2 標準曲線繪制 精密吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL， 分別置 25 mL 量瓶中，加水至12 mL，即得不同濃度的對照品溶液。按“2.3.1項”總酚酸顯色的方法，按照相同處理的空白顯色體系為空白對照，在760 nm波長處測定其吸光度。以吸光度A對濃度C建立標準曲線，得線性回歸方程：A＝89.874C＋0.0223，r＝0.999。 結果表明：沒食子酸在1.0～10.0 μg／mL范圍內，線性關系良好。

2.3.3 總酚酸含量測定 按2.2項制備供試品溶液，取供試液 1 mL置 25 mL瓶中，按 2.3.1項的方法測其吸光度，代入標準曲線計算，并按下式計算總酚酸得率：

總酚酸得率／%＝（總酚酸含量／藥材質量）×100%。

2.3.4 精密度試驗 分別精密移取供試品溶液和對照品溶液1 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按照“2.3.1項”顯色方法進行顯色，用紫外分光光度計連續測定6次吸光度。結果：對照品和供試品顯色吸光度RSD分別為0.11%和0.13%。

2.3.5 重復性試驗 精密稱取同批鹽膚木樣品0.5 g，6份，按“2.2項”制成供試品溶液；精密移取1 mL，按照“2.3.1項”顯色，測定其吸光度并代入標準曲線計算，得該批次鹽膚木根莖中總酚酸平均含量為3.58%，RSD為2.29%。

2.3.6 穩定性試驗 分別精密移取供試品溶液和對照品溶液1 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按照“2.3.1 項”顯色，分別在 35、50、70、90、130、150 min，測定樣品吸光度。從表1中可知：隨著顯色時間變化，樣品吸光度逐漸下降，而在130 min內樣品吸光度RSD為1.34%，表明樣品顯色后在130 min內穩定。

2.3.7 回收率試驗 取與重復性試驗同批鹽膚木樣品0.5 g 6份，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，加入近似樣品總酚酸含有量的對照品量（沒食子酸17.8 mg），按照“2.2項”制成供試品溶液；精密移取1 mL，按照“2.3.1項”顯色方法顯色，測定其吸光度并代入標準曲線計算，測得平均回收率為98.93%，RSD為2.82%。

表1 加樣回收實驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定 精密稱取與重復性試驗同批鹽膚木樣品0.5 g，平行測定3份，按“2.2項”制成供試品溶液；精密移取1 mL，按“2.3.1項”顯色，以相應的空白顯色體系試劑為空白對照，測定吸光度并代入標準曲線，計算總酚酸含量。見表2。

表2 鹽膚木根莖中總酚酸含量測定（x±s）

3 討論

3.1 根據前期預實驗結果，福林酚法具有所用的試劑量少、測定時間短、且在顯色過程相比于三氯化鐵-鐵氰化鉀顯色法更穩定的特點，因此本實驗采用福林酚法測定閩產鹽膚木根莖中總酚酸的含量。福林酚法經過方法學驗證，符合各項分析要求，且該方法準確、簡便、快速，可用于鹽膚木根莖中總酚酸的含量測定，為制定鹽膚木質量標準奠定基礎。

3.2 本實驗在供試品溶液進行顯色時候，最后是用29%碳酸鈉溶液進行定容。因為乙醇濃度過高會導致碳酸鈉析出，故本實驗采用少量供試品溶液進行測定或者將乙醇提取溶液進行濃縮，再重新用水去復溶。

3.3 采用福林酚法測定總酚酸時的顯色時間為35 min后，經穩定性考察，顯色后總酚酸吸光度在130 min內樣品吸光度RSD為1.34%，表明樣品顯色后在130 min內穩定。因此為了更加精確測定鹽膚木根莖中總酚酸的含量，應該在樣品顯色完之后，快速測定。

參考文獻：

［1］ 陳存武，張莉，何曉梅，等.鹽膚木總黃酮的提取研究［J］.湖南農業科學，2010（13）：119-122.

［2］ 高潔瑩，龔力民，劉平安，等.鹽膚木屬植物研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21（8）：215-218.

［3］ DJAKPO O，YAO W.Rhus chinensis and Galla Chinensis-folklore to modern evidence：review ［J］.Phytother Res.2010，24（12）：1739-1747.

［4］ 范世明，陳琳，林婧，等.福建不同產地三葉青葉中總黃酮含量比較［J］.福建中醫藥，2015，46（3）：38-40.

［5］ 張秀才，吳巖斌，吳錦玉，等.金線蓮總黃酮回流提取工藝研究［J］.福建中醫藥，2013，44（4）：53-55.

［6］ 牛雪.福林酚法測定葡萄酒總酚的優化研究［D］.銀川：寧夏大學，2015.