影響豌豆蛋白乳化特性的分子機制

盧菊慧 - 鐘 芳 陳茂深 -

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

豌豆是僅次于大豆的第二大食用豆類作物，淀粉和蛋白質(zhì)含量豐富，除食用外，主要用于生產(chǎn)豌豆淀粉及相關(guān)產(chǎn)品。豌豆蛋白在豌豆中的含量為21%～30%，是淀粉生產(chǎn)中的副產(chǎn)物，主要用作蛋白源添加到飼料中，造成了蛋白資源的浪費。

乳化特性是蛋白質(zhì)最重要的功能特性之一。在乳化過程中，油相在強烈的機械力作用下被打破形成小油滴，蛋白分子迅速吸附到油滴上并在界面上形成一層蛋白膜，阻止了油滴的聚集，從而形成具有一定穩(wěn)定性的乳液體系。界面層的組成和結(jié)構(gòu)受蛋白種類、組分及濃度等因素的影響，并對蛋白質(zhì)的乳化能力和穩(wěn)定性等有顯著影響。

近年來國內(nèi)外學(xué)者對豌豆蛋白的乳化特性進行了一系列研究，例如，Liang等[1-2]研究發(fā)現(xiàn)，豌豆分離蛋白在pH 3.0時具有皮克林乳化機制，且11S球蛋白的乳化特性最佳。彭偉偉[3]考察了未加熱和熱處理豌豆蛋白的乳化特性，發(fā)現(xiàn)其乳化活性和穩(wěn)定性隨著加熱溫度(50～100 ℃)的升高而增加。郭興鳳等[4]采用堿性蛋白酶水解豌豆蛋白，改善了乳化特性。

然而，目前關(guān)于豌豆蛋白穩(wěn)定乳狀液的研究主要集中于不同溫度、pH、酶解條件等對豌豆蛋白乳化效果的影響，尚未有對乳化特性與構(gòu)成豌豆蛋白的各組分關(guān)系進行完整的闡述，且缺乏有關(guān)豌豆蛋白在油水界面上的飽和吸附狀態(tài)、界面層組成及各蛋白組分競爭吸附等方面的機理探究。

本研究擬以豌豆蛋白粉為原料，通過研究蛋白濃度對豌豆蛋白乳化特性的影響，考察蛋白趨于飽和吸附時的乳化效果及界面吸附特性，探討構(gòu)成豌豆蛋白的各組分在乳化時的競爭吸附行為的規(guī)律，以期為豌豆蛋白粉作乳化劑的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

豌豆蛋白粉：S85F型，羅蓋特公司；

金龍魚精煉一級大豆油：益海嘉里食品營銷有限公司；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、無水碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、牛血清白蛋白、福林酚試劑、疊氮化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、鹽酸、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、過硫酸銨、考馬斯亮藍R-250：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

β-巰基乙醇、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺、四乙基乙二胺、Precision Plus Protein 預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)蛋白)：上海創(chuàng)賽科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

凱氏定氮儀：KDN-103F型，上海纖檢儀器有限公司；

數(shù)顯溫控消化爐：KDN-08C型，上海新嘉電子有限公司；

激光粒度分析儀：Mastersize 2000型，英國馬爾文公司；

紫外可見分光光度計：TU-1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

超景深三維顯微鏡：VHX-1000C型，基恩士(香港)有限公司；

垂直電泳儀：Mini-PROTEIN Tetra型，美國伯樂公司；

化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀：ChemiDoc XRS+型，美國伯樂公司；

高速分散機：T25型，德國IKA公司；

高壓均質(zhì)機：Panda PLUS 2000型，意大利GEA Niro Soavi 公司。

1.2 方法

1.2.1 豌豆蛋白粉的組成 以豌豆蛋白粉為原料，對其基本組成進行分析，具體如下：

(1) 水分測定：按GB 5009.3—2016常壓烘箱干燥法執(zhí)行。

(2) 總蛋白質(zhì)測定：按GB 5009.5—2010凱氏定氮法執(zhí)行。

(3) 灰分測定：按GB 5009.4—2010高溫灼燒法執(zhí)行。

(4) 碳水化合物測定：按GB/T 15672—2009苯酚硫酸法執(zhí)行。

1.2.2 豌豆蛋白粉的溶解特性 取1.6 g蛋白粉，加入20 mL 10 mmol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液，于30～90 ℃水浴中攪拌1 h，3 000 r/min離心15 min，凱氏定氮法測定上清液蛋白含量。

1.2.3 豌豆蛋白-大豆油乳液的制備 將豌豆蛋白分散液與大豆油按體積比9∶1混合，用高速剪切機在10 000 r/min分散2 min，用均質(zhì)機在45 MPa下均質(zhì)2次，加入疊氮化鈉(終濃度0.02 g/100 mL)抑制微生物生長。

1.2.4 乳液粒徑的測定 以去離子水和1% SDS溶液為分散劑，使用激光粒度分析儀測定乳液的粒徑分布和平均粒徑。大豆油和水的折射率分別為1.472和1.330。絮凝指數(shù)按式(1)計算[5]：

(1)

式中：

FI——絮凝指數(shù)；

d43水——乳液在分散劑為水時測得的體積平均粒徑，μm；

d43SDS——乳液在分散劑為1% SDS溶液時測得的體積平均粒徑，μm。

1.2.5 乳液的微觀結(jié)構(gòu) 取5 μL乳液，用去離子水適當(dāng)稀釋后置于載玻片上，用蓋玻片蓋好，采用超景深三維顯微鏡觀察，標(biāo)尺為20 μm。

1.2.6 乳液的的穩(wěn)定性 熱穩(wěn)定性：取新制乳液于90 ℃水浴中30 min，冷卻后測定乳液粒徑。貯藏穩(wěn)定性：取新制乳液于樣品瓶中，在25 ℃貯藏7 d，測定乳液的粒徑；另取新制乳液于樣品瓶中，在25 ℃垂直放置貯藏，測定30 d內(nèi)乳液的總高度和乳液分層后的下清層高度，按式(2)計算乳析指數(shù)[6]。

(2)

式中：

CI——乳析指數(shù)，%；

Hs——乳液的總高度，cm；

Ht——乳液分層后的下清層高度，cm。

1.2.7 界面蛋白吸附率的測定 參照Liang等[1]的方法并稍改動：取新鮮乳液在15 000 r/min離心30 min后，用注射器吸取下清層，過0.22 μm針頭式濾器，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用Lowry法[7]測定下清層的蛋白濃度。將油層和下清層取出后，剩余的沉淀部分采用凱氏定氮法測定蛋白含量。界面蛋白吸附率按式(3)計算：

(3)

式中：

AP——界面吸附蛋白吸附率，%；

C0——用于制備乳液的蛋白溶液中的蛋白濃度，mg/mL；

Cs——乳液離心后未吸附層(下清層+沉淀層)中的蛋白濃度，mg/mL。

1.2.8 蛋白質(zhì)電泳 采用蛋白質(zhì)電泳法分析界面蛋白組成，參照Peng等[8]的方法并稍作改動：將乳液離心后得到的未吸附層完全吸出后，用緩沖液重新分散吸附層，采用蛋白質(zhì)電泳法分析原豌豆蛋白和吸附層蛋白的組成。電泳條件：12.5%分離膠，4.0%濃縮膠，上樣量：7.5 μL。凝膠成像后用Image Lab軟件分析其蛋白條帶組成。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)用Origin 9.0軟件制圖，用SPSS 19.0軟件Duncan檢驗法進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蛋白粉的組成及溶解度

2.1.1 豌豆蛋白粉的組成 豌豆蛋白是豌豆提取淀粉后的副產(chǎn)物，其傳統(tǒng)提取工藝[9]為：

豌豆→清理、浸泡磨漿→分渣→離心分離→酸沉→離心→堿溶→噴霧干燥→豌豆蛋白粉

目前工業(yè)化生產(chǎn)銷售的豌豆制品中，法國羅蓋特公司生產(chǎn)的豌豆淀粉及豌豆蛋白最具代表性。因此，選擇羅蓋特S85F型豌豆蛋白粉作為研究乳化特性的原料，其基本成分見表1。由表1可以看出，豌豆蛋白的含量在80%以上，且灰分和碳水化合物的含量較高，可能是由蛋白質(zhì)提取時未能完全除去淀粉以及堿溶酸沉?xí)r引入鹽離子造成的。

表1 豌豆蛋白粉的基本成分(干基)Table 1 The composition of pea protein powder(dry basis) %

2.1.2 溫度對豌豆蛋白溶解度的影響 溫度對豌豆蛋白粉溶解度的影響見圖1。由圖1可以看出，水浴溫度低于50 ℃時，豌豆蛋白的氮溶指數(shù)(NSI)不足50%，表明溫度較低時豌豆蛋白粉的溶解性不佳。與沙金華等[10]在實驗室自提的豌豆蛋白在30 ℃時NSI可達60%相比，工業(yè)化生產(chǎn)的豌豆蛋白粉的水溶性較差。蛋白質(zhì)的乳化特性受其溶解性的影響，但由于豌豆蛋白粉的溶解度較差，如果只利用可溶出的蛋白部分作乳化劑，會造成原料的浪費，因此考慮將豌豆蛋白粉整體作為乳化劑，并考察其乳化特性和界面吸附行為。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖1 提取溫度對豌豆蛋白氮溶指數(shù)的影響

Figure 1 Effects of heat temperature on nitrogen solubility index(NSI)of pea protein

2.2 豌豆蛋白的乳化能力

將豌豆蛋白粉與水預(yù)混為蛋白濃度為1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，30.0 mg/mL的分散液，在30 ℃水浴下攪拌1 h，采用均質(zhì)法制備乳液，并測定其乳化特性。

2.2.1 乳液的粒徑 以水作為分散劑，可測得乳液中油滴絮凝體的粒徑分布；以1% SDS作為分散劑，可以抑制油滴間的僑聯(lián)絮凝，使油滴分散，從而測得乳液中單個油滴的粒徑分布[1]。豌豆蛋白-大豆油乳液的粒徑分布見圖2。由圖2可以看出，蛋白濃度≤5.0 mg/mL時，乳液的粒徑分布很寬；隨著蛋白濃度的提高，乳液的粒徑明顯降低，粒徑分布呈現(xiàn)雙峰、三峰的趨勢。

根據(jù)乳液的粒徑分布，可得出乳液的平均粒徑及絮凝指數(shù)，見表2。

圖2 蛋白濃度對豌豆蛋白-大豆油乳液在分散劑中 粒徑分布的影響

Figure 2 Effects of protein concentration on the diameter distribution of pea protein-soybean oil emulsions when the dispersant is water or 1% SDS

表2蛋白濃度對豌豆蛋白-大豆油乳液的平均粒徑

及絮凝指數(shù)的影響?

Table 2 Effects of protein concentration on the average diameter and flocculation index of pea protein-soy-bean oil emulsions

蛋白濃度/(mg·mL-1)乳液的平均粒徑/μmd43水d43SDSFI1.031.22±4.92d8.81±2.99c2.54±0.47b2.515.58±3.03c4.41±2.66b2.53±0.89b5.08.67±1.80b2.63±0.18ab2.30±0.34b10.05.50±0.25b1.47±0.47ab2.74±0.77b20.01.06±0.12a0.46±0.02a1.30±0.16a30.00.84±0.08a0.44±0.01a0.91±0.13a

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

乳液的平均粒徑和絮凝指數(shù)，可以反映乳液中油滴的絮凝狀態(tài)。由表2可知，當(dāng)?shù)鞍诐舛葟?.0 mg/mL增至30.0 mg/mL，乳液的平均粒徑從31.22 μm降至0.84 μm，絮凝指數(shù)從2.54降至0.91，說明乳液中油滴表面逐漸形成緊密的蛋白吸附層，有效抑制了油滴的絮凝和聚集。根據(jù)圖2和表2，蛋白濃度從20.0 mg/mL升至30.0 mg/mL，乳液的粒徑分布和平均粒徑的差異很小，即此時升高蛋白濃度，無法使油滴的粒徑顯著降低。

2.2.2 乳液的微觀結(jié)構(gòu) 采用超景深顯微鏡可觀察到豌豆蛋白-大豆油乳液中油滴的大小和聚集情況，見圖3。由圖3 可以看出，低蛋白濃度(1.0，2.5 mg/mL)時，蛋白含量不足以包裹所有油滴，可觀察到大量大于10 μm的油滴，且絮凝、團聚嚴(yán)重。提高蛋白濃度后，油滴尺寸顯著減小，粒徑大部分在5 μm以下，但仍存在少量的團聚現(xiàn)象。

2.3 豌豆蛋白的乳化穩(wěn)定性

乳液是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，隨著貯藏時間的推移，乳液中的油水兩相會逐漸分離以減小自由能，乳液發(fā)生分層、絮凝和聚結(jié)；而加熱處理是蛋白乳液在加工過程中的重要步驟。因此，對新制乳液進行90 ℃ 30 min熱處理或25 ℃放置7 d的貯藏試驗，考察乳液中油滴平均粒徑的變化，結(jié)果見表3。

由表2與表3中乳液的平均粒徑對比可知，豌豆蛋白濃度≥5.0 mg/mL時，乳液經(jīng)過熱處理或25 ℃貯藏7 d后的平均粒徑d43水的增量均<2 μm，表明豌豆蛋白乳液具有良好的熱穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。

圖3 不同濃度的豌豆蛋白所制乳液的超景深顯微圖Figure 3 The micrographs of emulsions with different pea protein concentration表3 熱處理或貯藏對豌豆蛋白-大豆油乳液平均粒徑的影響?Table 3 Effects of heat treatment or storage on the average diameter of pea protein-soybean oil emulsions

蛋白濃度/(mg·mL-1)熱處理后乳液的平均粒徑/μmd43水d43SDS貯藏后乳液的平均粒徑/μmd43水d43SDS1.032.48±0.75e8.54±0.10e30.18±3.59d13.51±0.27e2.523.39±0.18d3.88±0.03d17.76±2.32c3.96±0.02d5.08.51±0.46c2.86±0.01c8.71±0.76b2.82±0.01c10.07.49±0.15b1.66±0.02b6.83±0.60b1.99±0.02b20.01.08±0.12a0.46±0.02a1.27±0.13a0.48±0.01a30.00.84±0.10a0.44±0.01a1.05±0.02a0.44±0.01a

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

為了進一步考察豌豆蛋白乳液的長期穩(wěn)定性，對乳液在25 ℃貯藏30 d內(nèi)的表觀分層情況進行拍照，結(jié)果見圖4。

根據(jù)各蛋白濃度所制乳液在25 ℃貯藏30 d內(nèi)的上浮、分層情況，計算各乳液的乳析指數(shù)，結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，1.0，2.5 mg/mL蛋白所制乳液在7 d內(nèi)即發(fā)生分層現(xiàn)象，乳析指數(shù)達60%，說明此濃度下蛋白不足以覆蓋所有的油滴，油滴在短期內(nèi)發(fā)生聚集并上浮；蛋白濃度為5.0 mg/mL時，蛋白可以將油滴覆蓋，并維持短暫的穩(wěn)定性；蛋白濃度≥10.0 mg/mL 時，乳液僅發(fā)生輕微上浮，說明此時豌豆蛋白可以緊密包裹油滴，有效防止油滴聚結(jié)和乳析。

圖4 不同濃度的豌豆蛋白所制乳液的超景深顯微圖Figure 4 The micrographs of emulsions with different pea protein concentration

2.4 乳狀液體系中豌豆蛋白的界面吸附特性及組分間的競爭吸附

2.4.1 界面蛋白吸附率 (C0-Cs)可用來表示原豌豆蛋白分散液中參與乳化的蛋白含量，界面蛋白吸附率AP為吸附在界面上的蛋白占體系中總蛋白量的比率，結(jié)果見表4。

蛋白濃度為20.0，30.0 mg/mL時，所制乳液在25 ℃貯藏30 d內(nèi)無明顯分層現(xiàn)象

圖5 不同濃度的豌豆蛋白所制乳液的乳析指數(shù)隨貯藏時間的變化

Figure 5 Creaming index of emulsions with different protein concentrations during storage

由表4可知，隨著蛋白濃度的增加，界面上吸附的蛋白逐漸增多，AP從95.00%降至44.87%。由圖1可知，豌豆蛋白粉在30 ℃時的氮溶指數(shù)僅為36%，小于表4中的AP值，表明原分散液中的不溶蛋白也會參與吸附、乳化。蛋白濃度由20.0 mg/mL增至30.0 mg/mL，(C0-Cs)變化較小，AP明顯降低，表明此時界面吸附蛋白趨近于飽和狀態(tài)，界面蛋白膜趨于緊密。

表4豌豆蛋白-大豆油乳液在不同蛋白濃度下的界面蛋白吸附率?

Table 4 Proportion of interface adsorption of protein in emulsions with different pea protein concentration

蛋白濃度/(mg·mL-1)C0-Cs/(mg·mL-1)AP/%1.00.95±0.01a95.00±0.97f2.52.26±0.01b90.40±0.36e5.04.18±0.02c83.60±0.40d10.08.12±0.03d81.20±0.32c20.012.04±0.38e60.20±1.90b30.013.46±0.18f44.87±0.61a

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4.2 界面蛋白組成及競爭吸附 豌豆蛋白中的大部分蛋白為球蛋白，球蛋白可分為legumin(11S)和vicilin(7S)。11S球蛋白是六聚體(320～380 kDa)，由6對非共價亞基組成，每對亞基由1個酸性亞基(leg A，38～40 kDa)和1個堿性亞基(leg B，19～22 kDa)通過二硫鍵連接而成。7S球蛋白是三聚體(150～180 kDa)，由相對分子質(zhì)量為47～50，30～34，<19 kDa的亞基構(gòu)成[11]，且缺乏半胱氨酸，無法形成二硫鍵。此外，豌豆蛋白中還有一類伴豌豆球蛋白convicilin[12]，相對分子質(zhì)量為71～75 kDa，也有文獻將其歸為vicilin的1個亞基[13]。

非還原電泳反映了原豌豆蛋白的組成，而還原電泳可反映各蛋白亞基的構(gòu)成情況：在還原條件下，聚集體會發(fā)生解聚，11S球蛋白的二硫鍵會打開，分成leg A和leg B 2個亞基[14]。

為了研究蛋白濃度對乳液中吸附層蛋白組成的影響，對原蛋白進行了還原和非還原電泳分析，并對乳液的吸附層進行了非還原電泳分析，結(jié)果見圖6。用Image Lab軟件對電泳圖的條帶進行分析，原蛋白的組成見表5，乳液在不同濃度下的吸附層蛋白組成見表6。

由圖6和表5可知，在還原電泳的條件下，原豌豆蛋白中的各蛋白含量：7S球蛋白>11S球蛋白>convicilin>聚集體，在還原條件下聚集體仍然存在(分離膠頂端仍有淺條帶)，即SDS和β-巰基乙醇不能使所有的聚集體都解聚。在非還原電泳的條件下，聚集體占比達20.18%，而7S球蛋白的占比變化較小，說明聚集體中的7S球蛋白含量很低。

由圖6和表6可知，蛋白聚集體(分子量≥250 kDa)在乳化時可吸附在油水界面上。蛋白濃度≤5.0 mg/mL時，界

1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 2. 用于制備乳液的豌豆蛋白 3～8. 分別對應(yīng)蛋白濃度為1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，30.0 mg/mL時制備的乳液中的吸附層蛋白

圖6 豌豆蛋白和不同濃度蛋白所制乳液的吸附層蛋白的還原和非還原電泳圖

Figure 6 Reducing and non-reducing electrophoretogram of original pea proteins and adsorbed proteins in emulsions with different pea protein concentration

表5 原豌豆蛋白中的蛋白組成Table 5 Composition of proteins in the original pea proteins %

表6豌豆蛋白-大豆油乳液在不同濃度蛋白下的

吸附層蛋白組成

Table 6 Composition of proteins in adsorbed proteins in emulsions with different pea protein concentration

蛋白濃度/(mg·mL-1)聚集體/%Convicilin/%7S/%11S/%1.036.8012.7724.8025.632.546.039.8924.9019.185.035.309.0026.0729.6310.029.0711.7034.2524.9820.017.4713.8439.0529.6330.016.318.0245.3030.38

面上吸附的聚集體占比最高；隨著蛋白濃度的提高，聚集體的占比逐漸降低，7S、11S球蛋白的占比提高，且7S的吸附占明顯優(yōu)勢。在趨于飽和吸附的情況下(20.0，30.0 mg/mL)，界面蛋白含量：7S球蛋白>11S球蛋白>聚集體>convicilin，且聚集體含量略低于原蛋白組成，11S球蛋白的含量相比于原蛋白組成有顯著提高。

根據(jù)以上數(shù)據(jù)可推測：當(dāng)?shù)鞍缀坎蛔阋园偷螘r，絕大部分蛋白會吸附到界面上，且聚集體、不溶蛋白的吸附會造成空間位阻，阻礙7S、11S球蛋白的吸附。當(dāng)?shù)鞍缀砍渥銜r，在均質(zhì)時小分子的7S球蛋白遷移、吸附到界面上的速率較快，11S球蛋白次之，在小油滴形成時可以將其包裹住；而大分子的聚集體遷移速率慢，在吸附過程中處于劣勢。當(dāng)?shù)鞍缀口呌陲柡蜖顟B(tài)時，7S、11S球蛋白維持界面吸附的優(yōu)勢，聚集體占比進一步降低，直至略低于原蛋白組成，但整體占比波動較小，趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

在水包油型乳狀液體系中，豌豆蛋白中的可溶和不溶蛋白組分共同參與吸附、乳化，且當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_20.0 mg/mL時，油水界面可趨于飽和吸附狀態(tài)。隨著蛋白濃度的提高，界面蛋白含量逐漸增加并趨于飽和，而在各蛋白組分對油水界面的競爭吸附中，大分子聚集體逐漸喪失吸附優(yōu)勢，7S和11S球蛋白在界面吸附中取得并維持優(yōu)勢，且能夠更好地包裹和穩(wěn)定油滴，最終表現(xiàn)為更好的乳化能力和穩(wěn)定性。

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