耐多藥及廣泛耐藥MTB菌株對SQ109的耐藥性及其與北京基因型的關系

董文竹 王政 文舒安 張婷婷 霍鳳敏 董玲玲 李云絮 趙立平 黃海榮 高飛 逄宇

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)引起的慢性傳染病，主要的治療方法是依靠抗結核藥物進行規范的化療。但是常用的抗結核藥物異煙肼(INH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)等已經越來越多地被結核分枝桿菌所耐受。世界衛生組織(WHO)2017年全球結核病報告估算全球新發耐多藥結核病(MDR-TB)患者約為49萬例，其中，MDR-TB疫情最嚴重地區是印度、中國及俄羅斯；而其中約有5.6%的患者為廣泛耐藥結核病(XDR-TB)。治療MDR-TB及XDR-TB的一個重要途徑就是研發新的治療藥物。SQ109作為乙胺丁醇(EMB)類似物中篩選出的抗結核新藥，在體外實驗中表現出與INH和RFP具有協同作用，并且未見對其他抗結核藥物的拮抗作用[1]，但是其對MDR-MTB及XDR-MTB臨床分離菌株的抑菌效果在我國缺乏進一步研究。因此，筆者選取MDR-MTB及XDR-MTB臨床分離株，以微孔板阿爾瑪藍顯色法(micro-plate alamar blue assay，MABA)檢測菌株對于SQ109的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)，探究SQ109的體外抑菌效果。

材料和方法

1.菌株：收集首都醫科大學附屬北京胸科醫院2014年7月至2016年12月臨床分離培養陽性的MTB菌株。根據WHO建議，將對INH及RFP同時耐藥的109株菌株作為MDR菌株；將對INH及RFP同時耐藥，對氧氟沙星耐藥且對于阿米卡星、卷曲霉素、卡那霉素中的至少1種耐藥的114株菌株作為XDR菌株，兩種菌株共計223株。本研究中所有耐藥菌株均在國家結核病重點實驗室以絕對濃度法進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，且通過對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)進行抑制生長試驗鑒定為結核分枝桿菌復合群。

2.試劑儀器：藥敏試驗所用SQ109、7H9培養基藥粉購自美國Sigma公司；中性羅氏培養基購自珠海銀科公司；營養添加劑OADC購自美國BD公司；96孔板購自美國Coster公司；阿爾瑪藍購自美國Bio-Rad公司。

3.MABA藥敏試驗：SQ109的藥物終濃度為0.016～16.000 mg/L。將SQ109溶解后，用最高濃度進行2倍梯度稀釋，制成含藥的96孔板。將選取的菌株接種在中性羅氏培養基上，37 ℃培養4周，刮取新鮮菌落，用磨菌瓶研磨均勻。將菌液稀釋至1麥氏單位后再次稀釋1/20，加入預先加入藥物的96孔板中，每孔100 μl。每株菌株設立1個不含藥物的陽性對照孔。加入菌液后37 ℃培養7 d，每孔加入由20 μl 阿爾瑪藍和50 μl 5% Tween-80預混好的顯色液，37 ℃培養24 h后進行結果判讀。判斷標準是孔內液體呈紅色為有菌生長，呈藍色則無菌生長，以最后一個藍色孔的藥物濃度作為MIC值。按照以MIC值為橫坐標，菌株數或菌株所占百分比為縱坐標做圖，如果呈單峰態分布，流行病學界值(ECOFF值)被定義為能抑制99.9%的細菌群的濃度；對于雙峰態分布，ECOFF值則在2個峰值中間[2]。

4.菌株DNA提取：采用煮沸法粗提細菌DNA。刮取一環新鮮菌落到500 μl 三羥甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)(TE)緩沖液中，金屬浴加熱煮沸30 min以裂解細菌。然后，離心半徑8 cm，13 000 r/min離心5 min，取含有細菌DNA的上清液放入新的1.5 ml離心管中，作為PCR的DNA模板使用。

圖1 223株XDR和MDR臨床分離菌株對SQ109的MIC值頻數分布情況

5.北京基因型與非北京基因型菌株的分離：采用RD207基因作為北京基因型和非北京基因型的分離標準，即缺乏RD207基因者為北京基因型，含有RD207基因者為非北京基因型。RD207引物序列為：P1：CATGCGGCGATCTCATTGTT；P2：GCACTGTTACCCGCACTTTC。50 μl的PCR體系按照25 μl 2×PCR混合物，5 μl的DNA模板，各0.2 μl的上下游引物。PCR的擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物采用前述方法進行判讀。

6.EMB耐藥及敏感菌株的耐藥率比較：采用臨床羅氏培養及液體藥敏試驗結果中的EMB耐藥情況作為菌株分離標準，將菌株分為EMB耐藥菌株和EMB敏感菌株，比較兩者對SQ109耐藥率的差異。

7.統計學處理：應用SPSS 15.0軟件進行分析，計算MDR及XDR菌株、北京基因型及非北京基因型菌株、EMB敏感及耐藥菌株對SQ109的耐藥率；不同特征菌株耐藥率的比較，以及北京基因型和非北京基因型菌株在不同MIC值分布差異的比較均采用Fisher精確概率法檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1. MIC值檢測結果：223株XDR和MDR菌株的MIC值分布在<0.016～16.000 mg/L之間，主要集中在0.120 mg/L(38.1%，85/223)及0.250 mg/L(43.0%，96/223)。根據菌株對SQ109的MIC值頻數分布情況，確定ECOFF值為1.000 mg/L(圖1)。對SQ109總耐藥菌株數為5株，總耐藥率為2.2%(5/223)。其MIC值分別為4.000 mg/L(1/5)、8.000 mg/L(3/5)、16.000 mg/L(1/5)。XDR菌株中有5株對SQ109耐藥，耐藥率為4.4%(5/114)；MDR菌株中無耐藥菌株，耐藥率差異無統計學意義(Fisher精確概率法，P>0.05)，見表1。

2.不同基因型分離結果：109株MDR菌株中共分離出8株非北京基因型菌株，114株XDR菌株中共分離出10株非北京基因型菌株。205株北京基因型菌株MIC值范圍為<0.016～16.000 mg/L，主要集中在0.120 mg/L(39.0%，80/205)和0.250 mg/L(43.9%，90/205)；對SQ109耐藥菌株數為5株，耐藥率為2.4%。非北京基因型菌株的MIC值范圍為0.030～0.500 mg/L，主要集中在0.120 mg/L(27.8%，5/18)和0.250 mg/L(33.3%，6/18)；未發現對SQ109耐藥菌株。經比較，北京基因型和非北京基因型菌株耐藥率的差異無統計學意義(Fisher精確概率法，P>0.05)，見表2。

3.EMB敏感及耐藥菌株MIC值分布：223株菌株中共有138株EMB敏感菌株和85株EMB耐藥菌株。EMB敏感菌株的MIC值范圍為<0.016～8.000 mg/L，主要集中在0.120 mg/L(36.2%，50/138)和0.250 mg/L(46.4%，64/138)；對SQ109耐藥菌株為1株，其MIC值為8.000 mg/L，耐藥率為0.7%(1/138)。EMB耐藥菌株的MIC值范圍為0.016～16.000 mg/L，主要分布于0.120 mg/L(41.2%，35/85)和0.250 mg/L(37.6%，32/85)；對SQ109耐藥菌株為4株，耐藥率為4.7%(4/85)。經比較，EMB敏感和耐藥菌株對SQ109耐藥率的差異無統計學意義(Fisher精確概率法，P>0.05)，見表3。

討 論

MDR-MTB及XDR-MTB感染已成為全世界結核病治療的難題。為解決這個難題，新藥的研發成為關注的焦點。SQ109是從EMB類似物中篩選出來的具有潛力的新藥。該藥具有腸道吸收效果好，以及與INH、RFP具有協同作用，并與其他一線抗結核藥物無拮抗作用的優點。研究顯示，SQ109與RFP聯合使用時，在極低濃度下可對超過99%的MTB具有生長抑制作用，且對耐RFP的菌株均有效[1]。這使得SQ109對MDR-MTB及XDR-MTB具有較強的抑菌作用。SQ109的Ⅰ期臨床研究顯示，其在人體內無論是單一劑量還是多劑量使用時均具有良好的安全性及耐受性；而Ⅱ期臨床研究表明，SQ109單一療法每日劑量為75、150和300 mg或和標準劑量的RFP聯合使用時也表現出良好的安全性及耐受性[3-4]。

在本次研究中，XDR菌株對于SQ109的耐藥率為4.4%，低于同類試驗中的環絲氨酸(22.4%)、利奈唑胺(5.6%)、氯法齊明(5.6%)，與德拉馬尼(4.4%)、貝達喹啉(3.3%)結果相當[5-6]。顯示出SQ109對XDR菌株生長抑制作用較好。這對于目前幾乎“無藥可治”的XDR-TB具有重要意義。而本次實驗中，MDR菌株對SQ109的耐藥率和XDR菌株相比，差異無統計學意義，考慮可能由于樣本量較少所致，需要進一步擴大樣本量進行驗證。

ECOFF值是通過藥物MIC值估計的藥物最佳抑菌濃度，也就是當藥物濃度達到ECOFF值時，能夠抑制大部分細菌生長。本次研究通過MIC值確定的ECOFF值為1.000 mg/L，即當藥物濃度為1.000 mg/L時，可以有效抑制98.2%的菌株的生長，與國外同類研究結果相符[7]。而既往研究顯示，對MTB感染小鼠每天口服25 mg/kg的SQ109處理后，其血藥濃度峰值為0.135 mg/L。而通過檢測口服藥物的小鼠組織中的SQ109水平，發現肺部藥物濃度最高，其次為脾臟，肺部藥物濃度至少可以達到其MIC值的10倍水平，在用藥期間可以達到其血藥濃度的120倍，可以有效抑制MTB生長；而心臟、腦、血漿中藥物濃度較低[8-9]。所以，這個有效藥物濃度在小鼠實驗中的肺和脾臟中是可以達到的，但是在血漿、心臟、腦等組織中難以達到，也就是說SQ109可能對于肺結核的效果優于心包結核、結核性腦膜炎等肺外結核。而目前在小鼠實驗中也證實了SQ109在停止給藥后藥效仍能延續10～15 d[10]。這對于降低藥物口服頻率，簡化治療方案較為有利。但是，目前缺乏SQ109在人體中藥物濃度的研究數據，所以此ECOFF值還需要根據人體血藥濃度及組織中藥物濃度進行驗證。

在223株XDR及MDR結核分枝桿菌復合群臨床分離菌株中，實驗分離出205株北京基因型菌株。研究發現，在俄羅斯、越南、伊朗、愛沙尼亞、美國紐約等地區，北京基因型菌株與對藥物的耐藥率間存在明顯相關性，但是在印度尼西亞、阿塞拜疆、哥倫比亞等地區，北京基因型菌株和非北京基因型菌株在耐藥率方面的差異無統計學意義[5]；中國香港地區北京基因型分離株的耐藥率低于非北京基因分離株[5]。說明北京基因型菌株和耐藥率相關情況可能具有地區差異性。在對環絲氨酸、對氨基水楊酸藥物的研究中顯示，北京基因型和非北京基因型菌株耐藥率差異無統計學意義[5]；但是在對RFP研究中顯示，兩者差異具有統計學意義[11]，說明北京基因型菌株和耐藥率的相關情況也可能受到藥物類型及使用情況的影響。本次研究顯示SQ109的耐藥情況可能與北京基因型無關。但是，本次研究中非北京基因型菌株僅為18株，樣本量較少，因此，有待擴大樣本量做進一步研究。SQ109作為EMB的類似物，是否和EMB形成交叉耐藥也是臨床用藥的一個考慮要點。本次研究中，通過對MDR和XDR菌株中EMB敏感菌株和耐藥菌株的分離對比發現，EMB敏感和耐藥的菌株對SQ109的耐藥率差異無統計學意義。

最后，本研究僅對SQ109的體外抑菌情況進行了分析討論，在研究中出現的5株SQ109耐藥菌株的耐藥機制尚不明確，需要進一步做試驗驗證。

[1] Chen P, Gearhart J, Protopopova M, et al. Synergistic intera-ctions of SQ109, a new ethylene diamine, with front-line antitubercular drugs in vitro. J Antimicrob Chemother, 2006, 58(2): 332-337.

[2] Pang Y, Zheng H, Tan Y, et al. In vitro activity of bedaquiline against nontuberculous Mycobacteria in China. Antimicrob Agents Chemother, 2017, 61(5).pii: e02627-16.

[3] Sacksteder KA, Protopopova M, Barry CE 3rd, et al. Disco-very and development of SQ109: a new antitubercular drug with a novel mechanism of action. Future Microbiol, 2012, 7(7): 823-837.

[4] 中國防癆協會臨床專業委員會. 結核病臨床診治進展年度報告(2012年)(第二部分結核病臨床治療). 中國防癆雜志, 2013,35(7): 488-510.

[5] 楊健, 逄宇, 趙雁林, 等. 耐多藥結核分枝桿菌對環絲氨酸、對氨基水楊酸的耐藥性及其與基因型關系分析. 中國防癆雜志, 2015, 37(2): 122-127.

[6] Pang Y, Zong Z, Huo F, et al. In vitro drug susceptibility of bedaquiline, delamanid, linezolid, clofazimine, moxifloxacin, and gatifloxacin against extensively drug-resistant tuberculosis in Beijing, China. Antimicrob Agents Chemother, 2017, 61(10).pii: e00900-17.

[7] de Knegt GJ, van der Meijden A, de Vogel CP, et al. Activity of moxifloxacin and linezolid againstMycobacteriumtuberculosisin combination with potentiator drugs verapamil, timcodar, colistin and SQ109. Int J Antimicrob Agents, 2017, 49(3): 302-307.

[8] Jia L, Tomaszewski JE, Hanrahan C,et al. Pharmacodyna-mics and pharmacokinetics of SQ109, a new diamine-based antitubercular drug. Br J Pharmacol, 2005, 144(1): 80-87.

[9] Jia L, Noker PE, Coward L, et al. Interspecies pharmacokinetics and in vitro metabolism of SQ109. Br J Pharmacol, 2006, 147(5): 476-485.

[10] Bogatcheva E, Hanrahan C, Nikonenko B, et al. Identification of SQ609 as a lead compound from a library of dipiperidines. Bioorg Med Chem Lett, 2011, 21(18): 5353-5357.

[11] 王勝芬, 趙雁林, 黃海榮, 等. 結核分枝桿菌北京基因型菌株與耐藥表型的關系. 中國醫學科學院學報, 2009, 31(4): 427-431.