GeneXpert MTB/RIF在疑似肺結核患者診斷中的應用價值

王蔚 呂青山 郁勤龍 陳恒威 沈偉鋒

結核病是由結核分枝桿菌引起的嚴重危害人類健康的慢性傳染病，以肺結核多見。2017年WHO報告最新數據表明，我國2016年肺結核發病患者近87萬例，位居全球第三位，防治疫情仍較嚴峻[1]。目前，疑似肺結核患者篩查方法仍以痰涂片鏡檢和結核分枝桿菌培養為主，前者敏感度低，后者耗時長，均不能滿足臨床早期、快速診斷的需求。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，我國目前活動性肺結核患者約有75%為涂陰肺結核[2]，采用傳統涂片鏡檢方法無法及時發現該類患者，極易延誤病情，對結核病疫情控制極為不利，如何早期發現肺結核成為亟需解決的難題。利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(GeneXpert MTB/RIF，簡稱“Xpert檢測”)為基于熒光定量聚合酶鏈式反應技術(realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)，直接檢測標本中有無結核分枝桿菌感染及利福平耐藥基因，逐漸引起國內外關注。已有多家結核病參比實驗室、臨床研究中心采用涂陽或培陽標本對該檢測系統進行評估，認為該技術具有較高的敏感度和準確性[3-4]，但是對于初診疑似患者，尤其是涂陰肺結核患者的檢測效能的系統評估仍較少。筆者基于此背景，收集初診疑似肺結核患者痰標本，以臨床診斷和傳統藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)比例法為標準，分析Xpert檢測結核分枝桿菌和利福平耐藥性的效能，綜合評價Xpert檢測對初診疑似及涂陰肺結核患者的快速診斷價值。

資料和方法

一、臨床資料

收集2015年1月至2016年12月浙江省嘉興市第一醫院就診的361例初診疑似肺結核患者痰標本(均按照規范留取)，分別進行涂片熒光金胺O染色鏡檢(簡稱“涂片鏡檢”)、結核分枝桿菌MGIT 320液體培養(簡稱“液體培養”)和GeneXpert MTB/RIF檢測(簡稱“Xpert檢測”)，納入患者均為初次來我院就診，伴有咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、低熱、盜汗等臨床癥狀，或胸部影像學檢查的表現與活動性肺結核相似，且近2年內未使用過抗結核藥物的患者。361例疑似患者最終臨床診斷為：肺結核184例(50.97%)，包括男103例(55.98%)、女81例(44.02%)，年齡11～79歲、平均(44.67±12.03)歲；肺部感染162例(44.88%)；非典型分枝桿菌肺部感染15例(4.15%)。

二、診斷標準

1.涂陰肺結核[5]：必須具備以下標準：①至少3份痰標本抗酸桿菌涂片鏡檢陰性；②符合活動性肺結核病變的胸部X線攝影表現；③臨床上可排除其他非結核性肺部疾病。同時滿足以下輔助指標中的任何一項即可確診：①結核菌素皮膚試驗(PPD 5TU)強陽性；②血清結核抗體陽性；③痰結核分枝桿菌PCR熒光探針檢測陽性；④肺外組織病理學檢查證實結核病變。

2.肺部感染[6]：患者出現咳嗽、咳痰等癥狀，肺部可聞及濕性啰音，可出現發熱或白細胞計數增高或影像學檢查提示有炎性反應等。

3.非典型分枝桿菌肺部感染[7]：具有呼吸系統癥狀和(或)全身癥狀，胸部影像學顯示炎性病灶及單發或多發薄壁空洞，病變多累及上葉尖段和前段，CT可有結節影、斑片及小斑片樣實變影、空洞影、支氣管擴張、樹芽征、磨玻璃影、線狀及條索影等多種形態病變混雜存在，實驗室查痰菌2次培養到同一種非結核分枝桿菌。

三、儀器與試劑

金胺O染色液(杭州創新生物檢控技術有限公司)，CX40FL型熒光顯微鏡[寧波舜宇光學科技(集團)有限公司]；結核分枝桿菌BACTECT MGIT 320液體培養儀及配套試劑(美國BD公司)；GeneXpert MTB/RIF檢測系統和配套試劑(美國 Cepheid公司)；結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒膠體金法(杭州創新生物檢控技術有限公司)。

四、檢查方法

按照《結核病實驗室檢驗規程》[8](簡稱“《規程》”)分別進行以下檢查。

1.痰涂片鏡檢：留取痰液3～5 ml進行涂片、熒光染色及LED顯微鏡鏡檢(物鏡“×40”，目鏡“×10”)，暗視野下呈黃色熒光，桿狀略彎曲菌體為陽性結果；判讀標準為：0條/50個視野為陰性；1～9條/50個視野報告實際條數；10～49條/50個視野為“1+”；1～9條/每個視野為“++”；10～99條/每個視野為“+++”；100條及以上/每個視野為“++++”；報告“++”至少觀察50個視野，“+++”及以上的陽性結果至少觀察20個視野。

2.痰結核分枝桿菌液體培養：取痰液1～1.5 ml用N-乙酰半胱氨酸(NALC)-NaOH處理后，接種于BACTECT MGIT 320液體培養基進行液體快速培養，儀器自動報陽后對陽性管涂片抗酸染色鏡檢確認，同時采用結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒鑒定菌種。

3.Xpert檢測：取備用痰液1 ml置于無菌螺紋管中，加入樣本試劑(sample reagent)處理液2 ml，旋緊螺紋管，漩渦震蕩15～30 s，室溫靜置15 min，使痰標本充分液化。取2 ml 處理后樣品加入反應盒，將反應盒置于檢測模塊，儀器開始自動檢測。以ropB基因為靶序列，同時采用6種分子信標探針檢測，上述探針循環閾值(Ct值)≤38即為陽性，即5個探針中至少2個探針Ct值≤38即為檢測到結核分枝桿菌；對利福平的藥敏試驗：再根據特異性分子信標早期Ct值和晚期Ct值之差，即△Ct值確定是否對利福平耐藥，當△Ct值>3.5時提示對利福平耐藥，△Ct值≤3.5時提示對利福平敏感。由于終止循環數為38個循環，當早期探針Ct值>34.5或晚期探針Ct值>38時，結果為不確定[9]。

4.結核分枝桿菌固體藥敏試驗比例法：將培養陽性菌株采用比例法對4種一線抗結核藥物(利福平、異煙肼、鏈霉素和乙胺丁醇)進行耐藥性測試，判斷藥敏試驗結果。

5.菌種鑒定：采用免疫法，將培養陽性菌液滴入結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒，判斷是否為結核分枝桿菌。

6.病理學和影像學檢查：參照文獻[5]和[10]中的步驟及標準進行檢查及判讀。

五、相關公式

敏感度=真陽性例數/(真陽性例數+假陰性例數)×100%；特異度=真陰性例數/(真陰性例數+假陽性例數)×100%；陽性預測值=真陽性例數/(真陽性例數+假陽性例數)×100%；陰性預測值=真陰性例數/(真陰性例數+假陰性例數)×100%；正確指數=敏感度+特異度-1

六、統計學處理

使用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，以臨床診斷為金標準，采用卡方檢驗對涂片鏡檢法、培養法和Xpert檢測的結果進行比較分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、361例初診疑似肺結核患者的檢測情況

在361例初診疑似肺結核患者中，涂片鏡檢、液體培養和Xpert檢測的陽性率分別為22.71%、26.32%、32.41%；涂片鏡檢與Xpert檢測比較差異有統計學意義(χ2=8.49，P<0.05)；液體培養與Xpert檢測比較差異無統計學意義(χ2=3.23，P=0.072)，涂片鏡檢法與液體培養法比較差異也無統計學意義(χ2=1.26，P=0.261)。184例肺結核患者中，涂片鏡檢(36.41%)和液體培養的陽性率(48.91%)分別和Xpert 檢測結果(63.59%)比較，差異均有統計學意義(χ2=27.17，P<0.01；χ2=8.05；P<0.05)(表1)。

二、不同檢測方法對初診疑似肺結核患者的檢測效能：以臨床確診患者為金標準，計算3種方法的檢測效能，見表2。

三、Xpert檢測對涂陰肺結核患者的檢出情況

在184例肺結核患者中，涂片鏡檢陰性的117例標本中液體培養陽性29例，則涂陰肺結核患者的培養陽性率為24.79%；涂陰的117例標本中Xpert檢測陽性50例，Xpert檢測對涂陰肺結核患者的陽性檢出率為42.74%，具體見表3。液體培養和Xpert檢測對117例涂陰肺結核患者的陽性檢出率比較差異有統計學意義(χ2=8.43，P=0.004)。

表1 三種檢測方法對361例疑似肺結核患者的檢測結果

注括號外數值為“患者例數”，括號內數值為“比率(%)”

表2 三種方法以臨床確診患者為金標準的檢測效能

表3 涂陰肺結核液體培養和Xpert檢測的陽性檢出情況

注括號外數值為“患者例數”，括號內數值為“構成比(%)”

四、固體藥敏試驗比例法與Xpert檢測對培陽患者利福平藥敏試驗結果分析

按操作規程，以固體藥敏試驗比例法為標準，對90株培養陽性菌株進行固體藥敏試驗和Xpert檢測利福平ropB耐藥基因。結果顯示，固體藥敏試驗比例法有5株對利福平耐藥，其中4株Xpert檢測利福平耐藥、1株敏感，該敏感株經基因芯片檢測，檢測到ropB基因531(TCG-TTG)突變位點；另85株固體藥敏試驗比例法敏感菌株中有2株Xpert檢測利福平耐藥、83株敏感，對結果不相同的2株Xpert 檢測耐藥株進行基因芯片檢測，1株未檢測到ropB基因突變位點，1株為ropB基因531(TCG-TTG)突變。以固體藥敏試驗比例法結果為金標準，Xpert 檢測利福平耐藥的敏感度為4/5，特異度為97.70%(85/87)，正確指數為0.97(87/90)。因實驗室條件限制，進行基因芯片檢測的結果數據未進行測序。

討 論

肺結核是由結核分枝桿菌感染引起的傳染病，細菌學檢查是診斷的確切依據。我國目前主要依賴于痰涂片鏡檢進行肺結核的診斷與隨訪時療效的監測[11]。痰涂片鏡檢陰性的疑似肺結核患者診斷需根據結核分枝桿菌培養結果及患者臨床癥狀、影像學表現、病理學檢查等結果，耗時較長，對疾病控制極為不利。Xpert檢測系統基于熒光定量PCR技術，整合樣本制備、核酸純化濃縮和熒光定量PCR擴增的檢測過程，在一個封閉的試劑盒中自動完成，2 h內可得到檢測結果。早在2010年，WHO就發表聲明認可并推薦Xpert檢測在結核病防治規范中的應用，認為它對肺結核的診治具有里程碑式的意義[12]。

國內外已有較多文獻報道Xpert檢測系統在涂陽或培陽患者中的檢測效能。有資料顯示，Xpert檢測在肺結核涂陰培陽患者中的敏感度可達57%～76.9%，涂陽培陽患者中達98%～100%[13]。菌陰肺結核患者尤其是涂陰肺結核患者臨床表現不典型，胸部影像的空洞情況明顯少于涂陽患者[14]，癥狀較輕，個人不重視檢查，不能被及時發現；同時又缺乏細菌學診斷依據，臨床上診斷難度較大，極易造成漏診誤診。有研究報道，涂陰肺結核患者傳染性僅次于痰菌陽性的肺結核患者，與該群體密切接觸者被感染的概率達7.3%～21%[15]。因此，及時發現初診涂陰肺結核患者，對于控制結核病傳播，提高患者規范治療機會有著重要意義。

本研究通過對初診為疑似肺結核的患者進行痰涂片、結核分枝桿液體菌培養及Xpert檢測，發現在臨床診斷肺結核患者中，Xpert檢測方法的敏感度(63.59%)和特異度(100.00%)明顯高于涂片鏡檢(分別為36.41%和91.52%)和液體培養(分別為48.91%和91.52%)，但比文獻報道95%的敏感度略低[16]，分析原因可能與本研究患者選擇以臨床診斷為金標準有關，將臨床診斷為肺結核的初診患者納入研究，存在一定比率的菌陰或涂陰肺結核患者，而文獻中是以培陽或涂陽的患者為研究對象；Xpert檢測結果陽性預測值(100.00%)和陰性預測值(72.54%)均高于涂片鏡檢(分別為81.71%和58.06%)和液體培養(分別為85.71%和63.28%)，表明Xpert在初診疑似肺結核患者實驗室檢測中的效能遠高于涂片鏡檢和液體培養。

同時本研究顯示，對于117例初診涂陰肺結核患者，Xpert檢測的陽性率為42.74%(50/117)，即有近1/2的初診肺結核患者無法通過涂片鏡檢進行篩查，需根據結核分枝桿菌培養、臨床癥狀、影像學表現、血清學抗體檢測及組織病理學等方法相結合進行診斷。現通過Xpert技術可以直接檢測痰標本，降低了對患者的有創診療操作，可快速檢測到患者體內的少量結核分枝桿菌，及時進行干預。有文獻報道，與涂片鏡檢法相比，Xpert技術能使結核分枝桿菌檢出率提高11.7%～50.0%[17]。另有研究表明，對于菌陰肺結核采用支氣管灌洗液進行Xpert 檢測優于痰液標本，陽性率可達70%以上；但是對于存在采用纖維支氣管鏡支氣管灌洗液檢查禁忌證和其他特殊患者，仍建議采用痰液檢查，無創傷，標本易采集[18]。美國食品藥品監督管理局(FDA)曾在2015年發文表示，肺結核患者治療后可采用Xpert檢測痰標本，結果陰性作為早期解除呼吸道隔離的標準，對于可疑肺結核患者，可依Xpert檢測痰結果判斷是否需要進行呼吸道隔離[19]。我國2018年即將實施的最新肺結核診斷行業標準規定分子生物學檢測結核分枝桿菌陽性，同時滿足影像學表現的患者，即可確診肺結核[20]。因此，對于疑似肺結核患者，Xpert檢測結果可直接明確診斷，達到早期診斷、及時治療的目的；尤其對于初診涂陰患者，意義更加重大。

另一方面，在對培陽肺結核患者耐藥檢測中，以固體藥敏試驗比例法為金標準，Xpert檢測利福平耐藥的敏感度為4/5，特異度為97.70%(85/87)，與比例法檢測利福平藥敏試驗結果的正確指數達0.97，與文獻報道相似[9]。傳統固體藥敏試驗比例法耗時需4周，通過Xpert檢測的使用，可以快速預測利福平耐藥性，早期制定用藥方案。

綜上所述，作為結核病診治基層醫院，可推薦采用Xpert技術對疑似結核病患者進行檢測，及早發現結核感染與耐利福平肺結核，為患者創造治療與治愈結核病的機會，防止耐藥結核病的形成與播散。

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