不同濃度七氟醚麻醉對大鼠氧化應激及Caspase-9表達的影響

李繁，黎仕煥，黃奕弟

（1.海南醫學院第二附屬醫院 麻醉科，海南 海口 571100；2.海南醫學院第一附屬醫院 解剖教研室，海南 海口 570102）

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指接受手術治療的患者術后出現的中樞神經系統并發癥，其特征為記憶受損、焦慮、精神錯亂以及人格改變等，易發生在老年患者中[1]。近年來，有關POCD的發生與手術麻醉藥物之間的關系受到越來越多學者的關注。七氟醚是臨床常用的吸入型麻醉藥物，被認為是吸入麻醉的里程碑式藥物。其無色透明，芳香無刺激性，可迅速誘導麻醉，患者術中血液動力學平穩，且具有麻醉效果強，用量少，患者術后蘇醒快以及蘇醒透徹等優勢[2]。但有動物研究指出，七氟醚對大鼠的認知功能有影響，其可能的途徑為氧化應激反應、中樞神經系統炎癥反應、細胞內鈣離子穩定失調等[3]。還有動物研究指出七氟醚對大鼠神經系統有保護作用。有學者在近年來的一些研究中指出POCD發生機制可能是多種外源性因素對已經表現出退化的患者自身中樞神經系統的進一步損傷導致，主要為代謝功能和神經遞質傳遞功能受損[4]。POCD的發生是多種因素通過多個途徑，并涉及多個系統共同作用而引起的，但其發生機制到目前為止并未完全闡述清楚，有關吸入性麻醉方法對患者術后認知功能造成的影響也沒有明確的結論。因此，為了進一步探討和分析七氟醚和術后認知功能障礙發生之間的關系以及可能的機制，以減少臨床術后POCD的發生，提高治療效果，本研究以老年大鼠為研究對象，對其進行七氟醚處理，觀察在不同濃度七氟醚下大鼠認知功能所受到的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取80只18個月齡大小清潔級健康雄性大鼠作為研究對象進行研究，平均體重（537±55）g，均由第三軍醫科大學動物中心提供。采用隨機數字表法將其分為5組，分別為A組：吸入6 h 0%七氟醚+2 L/min氧氣；B1組：吸入6 h 1%七氟醚+2 L/min氧氣；B2組：吸入6 h 2%七氟醚+2 L/min氧氣；B3組：吸入6 h 3%七氟醚+2 L/min氧氣；B4組：吸入6 h 4%七氟醚+2 L/min氧氣。

1.2 實驗儀器與主要試劑

1.2.1 實驗儀器 美國Thermo scientific公司-80℃冰箱，德國西門子股份公司4℃冰箱，上海雷磁電化學儀器公司PHS-3C酸度計/pH計，美國Thermo scientific公司酶標儀，美國通用公司Solar 8000M型多功能生命監測儀，德國Drager公司Drager Fabius 8000型麻醉機，西南醫院麻醉科實驗室提供的自制鋼化玻璃麻醉誘導箱，德國Eppendorf公司微量加樣槍，法國Gilson公司微量移液器，美國UVP公司GDS800凝膠圖像分析軟件。

1.2.2 主要試劑 七氟醚（美國雅培公司），ELISA試 劑 盒、Amyloid precursor protein、APP、MDA及SOD ELISA試劑盒（上海滬尚生物科技有限公司），戊巴比妥鈉（美國Epitomics公司），ACE-1抗體（1︰1 000）（重慶海韻生物有限公司），煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，又稱還原性輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）（1 ︰ 5 000）（美國Chemieon公司），山羊抗兔IgG（H+L）抗體、HB-17顯影濃縮液（北京康為世紀生物公司），兔抗大鼠IL-6、IL-8、Caspase-9（美國Abcam公司），二抗（美國Santa Cruz公司）。

1.3 實驗方法

所有實驗動物在實驗前1周被置于恒溫的動物房內，晝夜比1︰1，可自由取食。透明麻醉誘導箱內鋪適量鈉石灰，密封好，將實驗動物均置于其中，通過螺紋管將Drager Fabius型麻醉機與麻醉箱一側孔相連接，將另一側作為排氣口，與螺紋管相連接，在排氣口同時應用Solar 8000M型多功能氣體檢測儀監測麻醉箱內部七氟醚的濃度。實驗開始時各組大鼠分別吸入相應濃度的七氟醚+2 L/min氧氣，持續時間為6 h，持續應用烤燈在該過程中進行加熱，以維持大鼠體溫（肛溫）在（37.0±0.5）℃的范圍內。應用Solar 8000M型多功能氣體檢測儀同時監測二氧化碳CO2和殘余氣體的濃度，并調節揮發罐中七氟醚的揮發濃度，維持誘導箱中七氟醚的濃度在相應的濃度范圍內。預實驗時，已經對各組老年大鼠在吸入過程中的血氣測定維持在正常的范圍內。6 h后停止吸入，之后再繼續對各組大鼠吸入0.5 h 100%氧氣，清醒后將其放回到恒溫動物房中，自由取食。麻醉24 h后，從各組大鼠中隨機各取8只注射戊巴比妥鈉麻醉，然后將其迅速斷頭處死，快速在在覆蓋有無菌錫箔紙的冰袋上分離出海馬，放置在液氮中24 h冷凍存后放置在-80℃的冰箱中冷凍保存，以進行剩余指標的檢測。其余的大鼠則立即開始水迷宮訓練。

1.4 檢測指標

1.4.1 水迷宮實驗 完成七氟醚麻醉24 h后開始對各組大鼠進行水迷宮實驗，實驗持續5 d，均在上午9點鐘開始，采用ZH00 65型Morris水迷宮系統進行認知功能的測定，前4 d進行定位航行實驗，第5 d進行空間探索實驗，水溫維持在23℃。注意在整個實驗過程中要保證實驗室中物品拜訪以及燈光等室內環境一致。固定一個進水點，將各組大鼠從該處面向池置入水中，記錄其在2 min內尋找平臺的時間并在平臺上停留0.5 min（逃避潛伏期）。若大鼠在2 min內未找到平臺并在平臺上停留，則在第5 d時將隱匿在水中的平臺撤出，從固定點處放入子代大鼠，記錄其2 min內穿越前期留置平臺所在象限的次數及其在平臺所在象限停留的時間。

1.4.2 大鼠海馬內 APP、Aβ1-42、MDA、SOD水平檢測 采用酶聯免疫吸附法進行測量。將凍存在-80℃冰箱中的大鼠海馬標本取出，稱重后置于含有50 mmol/L蛋白酶抑制劑和2%烷基硫酸鈉的磷酸鹽緩沖液中，在4℃下離心20 min，轉速為12 500 r/min，取上清液。預先配置好實驗過程中需要的工作液，測定開始前0.5 h將試劑盒從冰箱中取出，放置其至常溫。APP、Aβ1-42、MDA、SOD水平的測定依照試劑盒說明書進行：首先在反應孔中加入標準品和稀釋的樣品，將反應孔使用封板膠紙密封，輕搖后放置在溫度為37℃的孵育箱中孵育1 h。然后完全甩盡板內的液體，用洗滌液洗滌每孔，洗滌結束后盡量拍干水分，重復5次以上操作。加入顯色液AB后混合均勻，避光放置在37℃的孵育箱中，10 min顯色結束后分別在每孔中放入終止液反應0.5 min，10 min內讀取吸光度（optical density，OD）值。以縱坐標為OD值，橫坐標為標準液繪制濃度標準曲線，并根據檢測獲得的OD值尋找出樣本的濃度。

1.4.3 大鼠海馬內炎癥因子和Caspase-9表達水平檢測 采用Western blot進行檢測。將大鼠海馬標本置入-80℃冰箱冷凍保存取出，稱重后按照1︰10（g/L）的比例加入蛋白提取試劑，勻漿后在4℃下離心15 min，轉速為12 500 r/min，取上清液。蛋白定量按照BCA試劑盒說明書進行。根據目的蛋白的相對分子量進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯氨酰電泳凝膠（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的配置，并根據蛋白的濃度調整上樣量，電泳分離后行蛋白質轉膜。將5%的脫脂牛奶作為封閉溶液，在37℃下輕微搖動2 h，之后分別加入IL-6、IL-8、Caspase-9、NADPH和一抗BACE-1進行雜交反應。在4℃條件下輕搖過夜，用磷酸緩沖液漂洗膜，5 min/次，共進行3次。然后加入羊抗兔IgG抗體進行雜交反應，37℃下孵育1.5 h，再用磷酸緩沖液漂洗膜，10 min/次，共3次。加入發光試劑顯影，在暗室內行X射線膠片曝光，顯影定影。再應用GDS800凝膠圖像分析軟件進行半定量分析，膠片上BACE-1和內參灰度之間的比值為BACE的表達水平。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0統計軟件，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，不同時間點的比較采用重復測量設計的方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組大鼠水迷宮實驗結果

結果表明：不同時間點的潛伏期差異有統計學意義（F=18.213，P=0.000），不同時間點的游泳路程差異也有統計學意義（F=29.376，P=0.000）；5組靜息狀態下的潛伏期和游泳路程差異有統計學意義（F=17.564和21.217，均P=0.000）；5組的潛伏期變化趨勢差異有統計學意義（F=8.219，P=0.000），而5組游泳路程的變化趨勢比較差異無統計學意義（P＞0.05）。第5天的空間探索實驗結果顯示，各組大鼠穿越平臺次數與平臺所在象限停留時間隨著吸入七氟醚濃度的增加而逐漸減少，其中B1組穿越平臺象限次數及停留時間與A組比較差異無統計學意義（P＞0.05），而B2、B3、B4組與A組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。同時，B2、B3、B4組穿越平臺象限次數及停留時間與B1比較差異有統計學意義（P＜0.05），但3組間穿越平臺象限次數及停留時間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2 5組大鼠APP、Aβ、BACE-1水平比較

B1組大鼠海馬內APP和Aβ1-42蛋白表達與A組比較差異有統計學意義，B2、B3、B4組與A組和B1組比較差異有統計學意義（P＜0.05），3組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）；B1、B2、B3、B4組大鼠海馬內BACE-1表達隨七氟醚濃度增加而逐漸增加，B3、B4組大鼠海馬內BACE-1表達水平高于A、B1和B2組（P＜0.05），兩組間比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 5組大鼠氧化應激相關指標比較

與A組比較，B1、B2、B3、B4組大鼠海馬內MDA含量隨七氟醚濃度升高而升高，SOD含量下降，其中B3、B4組大鼠海馬內MDA含量高于A組，SOD含量則低于A組（P＜0.05）；B1和B2組MDA和SOD含量與A組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表1 5各組大鼠水迷宮實驗結果比較 （n =8，±s）

表1 5各組大鼠水迷宮實驗結果比較 （n =8，±s）

注：1）與 A 組比較，P ＜0.05；2）與 B1組比較，P ＜0.05

組別平臺所在象限停留時間/s 1 d 3 d 4 d 1 d 3 d 4 d逃避潛伏期/s 游泳路程/cm 穿越平臺象限次數A 組 59.6±0.7 22.1±17.3 10.3±3.1 1 197±563 892±554 497±208 4.3±1.1 38.2±3.3 B1組 59.9±0.6 38.2±18.5 20.4±16.1 1 330±482 1 015±196 641±312 3.0±1.6 37.9±3.5 B2組 58.6±0.5 35.9±12.1 19.3±18.5 1 120±681 971±333 578±456 2.5±0.71）2） 27.7±2.61）2）B3組 59.3±0.6 41.2±20.7 31.0±15.8 1 479±4151） 1 033±422 790±539 1.7±1.81）2） 26.8±2.71）2）B4組 59.1±0.7 51.2±18.61） 34.2±20.81） 1 503±682 1 244±53 891±586 1.2±1.31）2） 26.1±3.01）2）

2.4 5組大鼠海馬內炎癥因子指標及Caspase-9表達水平比較

與A組比較，B1、B2、B3、B4組大鼠海馬內IL-6、IL-8表達隨七氟醚濃度增加而增強，B2、B3、B4組與A組比較差異有統計學意義（P＜0.05），B1組和A組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。與A組比較，B1、B2、B3、B4組大鼠海馬內Caspase-9表達隨七氟醚濃度增加而增強，B3、B4組與A組比較差異有統計學意義（P＜0.05），B1、B2組與A組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 4。

表2 5組大鼠海馬內APP、Aβ、BACE-1表達水平比較 （n =8，±s）

表2 5組大鼠海馬內APP、Aβ、BACE-1表達水平比較 （n =8，±s）

注：1）與 A 組比較，P ＜0.05；2）與B1組比較，P ＜0.05；3）與 B2組比較，P ＜0.05；4）與 B3組比較，P ＜0.05

組別 APP/（ng/L） Aβ/（ng/L） BACE-1 A 組 7.8±2.1 176.3±29.4 0.51±0.12 B1組 8.6±2.01） 217.8±30.11） 0.57±0.14 B2組 10.2±1.91）2） 251.0±28.31）2） 0.58±0.11 B3組 13.8±2.41）2）3） 387.2±33.71）2）3） 1.03±0.2111）2）3）B4 組 16.5±2.71）2）3）4） 465.3±40.11）2）3）4） 1.37±0.261）2）3）4）F值 13.035 14.944 7.961 P值 0.000 0.000 0.000

表3 5組大鼠海馬內MDA和SOD含量比較（n =8，±s）

表3 5組大鼠海馬內MDA和SOD含量比較（n =8，±s）

注：?與A組比較，P ＜0.05

組別 MDA/（nmol/mg） SOD/（u/mg）A組 4.61±0.64 101.3±13.4 B1組 4.76±0.69 105.9±13.7 B2組 4.88±0.73 107.2±14.1 B3組 14.35±1.92? 65.1±9.7?B4組 15.67±2.24? 55.6±8.9?F值 9.871 9.732 P值 0.000 0.000

表4 5組大鼠海馬內IL-6、IL-8及Caspase-9表達水平比較 （n =8，±s）

表4 5組大鼠海馬內IL-6、IL-8及Caspase-9表達水平比較 （n =8，±s）

注：1）與 A 組比較，P ＜0.05；2）與 B1組比較，P ＜0.05

組別 IL-6 IL-8 Caspase-9 A 組 0.33±0.07 0.35±0.08 0.33±0.06 B1組 0.41±0.06 0.43±0.06 0.42±0.08 B2組 0.67±0.071）2） 0.68±0.061）2） 0.46±0.09 B3組 0.76±0.051）2） 0.80±0.051）2） 0.82±0.091）B4組 0.89±0.061）2） 0.87±0.071）2） 0.89±0.111）F值 5.940 5.934 4.073 P值 0.000 0.000 0.001

3 討論

臨床接受手術治療的老年患者隨著老齡化社會的到來逐漸增多，就老年患者而言，更容易出現術后認知障礙（post operative congnitive dysfunction，POCD），具體表現出記憶力損傷、情緒變化、精神錯亂、人格改變等特征性癥狀[1]。國外研究指出，POCD的發生是多種因素共同作用的結果，包括心腦精神疾病、高齡、營養不良、感官缺陷、心理因素、長期服用某些藥物等[5]。很多研究證實，隨著年齡的增長，POCD的發生率明顯增加，尤其是年齡在70歲以上的老年患者。在臨床上，POCD更容易發生在經歷心臟等大手術接受全身麻醉的老年患者中[6]。雖然手術治療方式確實幫助很多老年人的原發疾病得到有效的治愈，但POCD的發生卻無法忽視，其給患者的生理、心理、經濟，以及整個社會帶來巨大的負擔，嚴重影響著老年患者術后的生活質量。本研究以容易在接受麻醉后出現POCD的老年大鼠作為對象進行研究，分別對其進行較長時間的七氟醚吸入麻醉，其麻醉后的水迷宮實驗結果證實POCD的發生。近年來，有學者指出亞麻醉濃度的七氟醚吸入（1.3%濃度）在能夠在一定程度上改善大鼠學習記憶功能，但也有研究指出七氟醚是導致大鼠認知功能的原因之一[7-8]。因此，本研究則進一步對不同濃度的七氟醚吸入對老年大鼠認知功能的影響作用進行探討，分析其作用機制，以幫助臨床選擇合理濃度的七氟醚麻醉。

七氟醚被人多麻醉學家認為是吸入麻醉的里程碑式藥物，具有起效快、麻醉作用強、對氣道刺激小、對血液動力學影響小等優勢，被廣泛應用兒童和老年患者全麻誘導中。研究指出，七氟醚導致POCD的發生，其可能的機制為：①促進腦內β淀粉樣單體寡聚化，從而導致海馬內tau蛋白過度磷酸化并喪失生理功能；②誘導炎癥反應和細胞凋亡；③干擾氧化還原平衡產生大量氧自由基[9-10]。Morris水迷宮是常用的從行為學角度評價動物空間學習記憶能力的一種方法，常用于觀察實驗動物空間認知能力的變化以及藥物對實驗動物學習和記憶能力的影響[11]。本實驗中對所有組的老年大鼠在5 d的水迷宮訓練中發現，各組大鼠隨著訓練時間的延長，其找到平臺的時間和運動的路程均逐漸縮短，這提示通過水迷宮訓練各組大鼠的學習記憶能力都有所增強。但研究結果也顯示出大鼠的潛伏期隨著七氟醚吸入濃度的升高而增長，這說明高濃度的七氟醚吸入會影響大鼠的學習能力。此外，研究結果還提示吸入高濃度七氟醚的大鼠在撤去平臺后其尋找平臺花費的時間更長，其軌跡也更加混亂，這說明老年大鼠吸入七氟醚的濃度越高，其學習和記憶能力受到的損傷也更大。

Aβ是POCD重要的病理學指標之一[12]。POCD和阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）具有相似的病理學過程：β-分泌酶和γ-分泌酶的先后酶切作用使得APP產生Aβ，在正常人體狀態下，非寡聚狀態下的Aβ40和寡聚狀態下的Aβ42維持動態平衡。當APP使得Aβ的產生增加時，寡聚化Aβ會加速沉積，從而產生神經毒性。本實驗結果發現，隨著七氟醚吸入濃度的升高，Aβ沉積增多，進而發生POCD的風險也就越高。分析該過程的機制可能是七氟醚可激活Caspase，并促使細胞凋亡，APP和BACE-1表達會隨之增加，最終Aβ也會相應增加。淀粉樣前體蛋白-APP是一種在多種組織中表達的膜內在蛋白，可在神經元的突觸部位集中。作為一種急性反應蛋白，APP在炎癥反應、短暫全腦缺血等應激狀態下其表達水平會升高。APP可被α-、β-、γ-等蛋白酶分解，其中β-和γ-蛋白酶的連續作用會使得APP分解產生Aβ。本實驗發現，七氟醚的濃度也會影響APP的表達，尤其是當七氟醚濃度超過3%時，APP的表達會明顯升高。作為一種刺激性因素，七氟醚可增加APP mRNA的轉錄，從而提高APP的表達水平。同時在APP的分解過程中，BACE-1是起關鍵作用的限速酶，其表達水平會直接影響Aβ的水平[13]。本研究發現對老年大鼠進行七氟醚處理后，其海馬內BACE-1表達水平增加，而且隨著七氟醚濃度的升高，其增加幅度也升高。但低濃度的七氟醚對BACE-1水平無明顯影響，分析原因可能是短時間、低濃度的七氟醚吸入對神經細胞凋亡和學習記憶能力的影響作用較小。

SOD則是一種能夠消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質的活性蛋白酶，是生物體內清除氧自由基的首要物質。MDA則是機體在酶系統和非酶系統的作用下產生的脂質過氧化物，其可對生物膜中多不飽和脂肪酸進行攻擊，進而引發脂質過氧化作用，MDA的測量結果往往可以反映出機體脂質過氧化的程度以及細胞受損的程度。有研究指出七氟醚可激活內皮細胞鈣依賴蛋白酶產生大量的氧自由基，進而導致氧化應激[14]。本研究結果顯示，老年大鼠經七氟醚麻醉后其海馬內的SOD含量降低，而MDA含量升高。這提示七氟醚引發的氧化應激也有可能是七氟醚導致POCD的機制之一。本研究結果還顯示，七氟醚的濃度與IL-6、IL-8等炎癥因子以及Caspase-9的表達具有相關性，隨著濃度的增加，B1、B2、B3及B4組老年大鼠IL-6、IL-8和Caspase-9表達增加，這說明炎癥反應也參與了七氟醚麻醉導致大鼠發生POCD的過程。同時炎癥反應和細胞凋亡之間關系密切，而研究發現Caspase家族中的Caspase-9則是導致細胞凋亡所必須的物質，是細胞凋亡的起始者[15]。本研究發現，七氟醚在引發炎癥反應的同時也增加了Caspase-9的表達，提示七氟醚可通過誘導炎癥反應和促使細胞凋亡來引發POCD的發生。

綜上所述，七氟醚和老年大鼠手術后POCD的發生密切相關，且呈現濃度依賴性的特征，在七氟醚濃度高于3%時，老年大鼠認知功能在麻醉后發生明顯改變。分析其機制可能與APP和Aβ的生成，誘導氧化應激、以及促進炎癥反應發生和細胞凋亡有關。

參 考 文 獻：

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