絕經期和生育期雌激素缺乏對小鼠免疫系統的影響

唐飛 徐娟 邵明君

21世紀人口老齡化對人類社會是一個重大的挑戰，我國目前已步入老年型社會，相關老年疾病如骨質疏松癥、心血管疾病、感染性疾病、尿失禁等嚴重影響絕經婦女的生活質量。隨著2002年婦女健康倡議研究問世，有關激素治療的臨床應用與利弊分析再次成為世界各國關注的熱點。眾所周知，人類內分泌系統與免疫系統相互影響，雌激素（E2）通過影響細胞因子分泌而影響免疫功能[1]，然而有關絕經期細胞因子模式的詳盡報道國內較少。本研究觀察E2缺乏狀態下年輕與老齡化小鼠之間是否存在免疫系統的差異，為進一步研究E2缺乏和免疫老化的關系提供實驗依據，也為臨床E2治療對絕經婦女免疫功能的影響提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 清潔級健康雌性C57BL/6小鼠100只，鼠齡2月齡（75只）和10月齡（25只），由杭州師范大學動物實驗中心提供。2月齡小鼠采用隨機數字表法分為手術去卵巢組、藥物去卵巢組和發情間期組，10月齡小鼠擬為自然絕經組，每組25只；其中手術去卵巢組、藥物去卵巢組和自然絕經組為3組實驗組，發情間期組為對照組。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制作 （1）手術去卵巢組：每只小鼠腹腔注射3%戊巴比妥40mg/kg麻醉，經鼠背面切口切除雙側卵巢[2]；（2）藥物去卵巢組：每只小鼠背部肌肉注射丙氨瑞林（安徽豐原制藥股份有限公司，批號：20041904）100μg/（kg·d），連續3個月[3]；用藥后20d逐只進行陰道脫落細胞涂片，顯微鏡下觀察小鼠動情周期變化，1次/d，連續5d內不出現動情周期者為去勢成功。（3）自然絕經組和對照組：無干預措施，普通級飼養。

1.2.2 小鼠發情間期和絕經期的判定 采用陰道細胞學檢查，用小棉簽蘸取少量0.9%氯化鈉溶液，擦取小鼠陰道內分泌物順時針涂在載玻片上晾干，用95%乙醇溶液固定，經HE染色后在10×10倍光鏡下觀察。若鏡下見有大量白細胞及少量有核細胞為發情間期[4]，全部是無核角化細胞或間有少量上皮細胞為發情期；連續5d鏡下觀察陰道分泌物涂片，呈現不規則動情周期者為絕經期[5]。手術去卵巢組、藥物去卵巢組于手術或使用藥物后20d開始判定，自然絕經組和發情間期于3個月后開始判定，所有小鼠3個月后進行實驗，實驗前4h采用刀豆蛋白A（Con A）（10mg/kg）尾靜脈注射直接誘導靜息T細胞的活化、增殖和分化[6]。

1.2.3 各組血清免疫球蛋白（Ig）M、IgG、IgA和E2水平檢測 實驗采用斷頸處死法取小鼠雙眼眶靜脈血，經2 325r/s離心后取出血清，置于-80℃低溫冰箱保存送檢，采用雙抗體夾心ELISA法檢測各組血清IgM、IgG、IgA和E2水平。待測樣品孔加入樣本40μl，然后各加入抗 E 抗體 10μl、鏈霉親和素-HRP 50μl，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60min；每孔加滿洗滌液，重復洗滌3次；每孔加入顯色劑100μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10min；最后每孔加終止液50μl終止反應，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD）值。

1.2.4 CD4/CD8比值檢測 每管加入熒光抗體CD8a 2μl+CD4 2μl+CD3 5μl+CD45 2μl，加入小鼠全血（EDTA 抗凝）100μl，混勻。陰性對照管：僅全血 100μl，不加試劑。室溫避光20min，加入1 000μl溶血劑，5min后1 500r/min離心5min，去除上清液。加入PBS緩沖液（血液分析儀鞘液）1 000μl，混勻，1 500r/min 離心 5min，去上清液，加入PBS緩沖液（血液分析儀鞘液）100μl，混勻。流式細胞分析儀設門，樣本上機檢測。

1.2.5 IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法。取小鼠新鮮脾臟組織100mg，經液氮冰凍后Trizol法提取總RNA用以檢測IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達水平，引物由上海生工生物有限公司合 成 ，IL-2 mRNA 正 義 引 物 ：5′-TACAGCGGAAGCACAGCA-3′，反義引物：5′-CGCAGAGGTCCAAGTTCATC-3′；IL-4 mRNA 正義引物：5′-AACGAGGTCACAGGAGAAGG-3′，反義引物：5′-TTGGAAGCCCTACAGACGAG-3′；IL-5 mRNA 正義引物：5′-CCCTCATCCTCTTCGTTGC-3′，反義引物：5′-ATCCTCCTGCGTCCATCTG-3′；IL-10 mRNA 正義引物：5′-TGCACTACCAAAGCCACAAG-3′，反義引物：5′-TGATCCTCATGCCAGTCAGT-3′；以 β-actin 作為內參照，正義引物：5′-GCATGGCCTTCCGTGTTC-3′，反義引物：5′-GATGTCATCATACTTGGCAGGTTT-3′。RT-PCR反應體系如下:熒光標記染料 2×SYBR Green I Master Mix 5μl，正義引物 0.2μl，反義引物 0.2μl，小鼠脾臟 cDNA 1μl，滅菌三蒸水補至總體積 10μl。條件為：95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 15s，72℃ 5min，39 個循環。將以上 PCR 擴增試劑加入96孔反應板中，離心3min，3 000r/min，然后放入Bio-Rad CFX-384熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）反應。反應結束后，應用SDS分析軟件（美國應用生物系統公司）進行分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清E2水平比較 3組實驗組小鼠血清E2水平均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；而3組實驗組小鼠血清E2水平兩兩比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

2.2 各組小鼠血清IgM、IgG、IgA水平比較 3組實驗組小鼠血清IgM、IgG水平均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。手術去卵巢組小鼠血清IgM、IgG和IgA水平均低于藥物去卵巢組和自然絕經組，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表2。

表1 各組小鼠血清E2水平比較

表2 各組小鼠血清IgM、IgG、IgA水平比較（μg/ml）

2.3 各組小鼠血清CD4/CD8比值比較 自然絕經組CD4/CD8比值低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；手術去卵巢組、藥物去卵巢組與對照組CD4/CD8比值比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 各組小鼠血清CD4/CD8比值比較

2.4 各組小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達水平比較 3組實驗組小鼠IL-2、IL-4、IL-5 mRNA表達水平均明顯低于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.01）；各組小鼠IL-10 mRNA表達水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表4。

3 討論

隨著年齡的增長，機體產生抗體減少，固有免疫和非特異性免疫功能均下降，有證據表明，除了年齡因素以外，絕經期卵巢功能下降導致E2缺乏可能與此變化有關[7]，而E2治療可以阻止或恢復部分免疫缺陷，維持細胞因子和淋巴細胞的動態平衡[8]。有研究提示性激素與婦女免疫功能關系密切，可能通過免疫系統影響腫瘤的發生與發展[9]。然而，E2缺乏和免疫老化的關系仍未明確，有關絕經小鼠細胞因子模式的報道國內較少。筆者前期的實驗初步發現去卵巢小鼠進行3個月生理劑量E2補充，未發現對Ig有影響[10]，故本研究進一步通過手術和藥物去卵巢小鼠經Con-A刺激后檢測E2缺乏狀態下年輕與老齡化小鼠之間是否存在此類細胞因子表達的差異，以證實E2是否影響此類細胞因子表達。

表4 各組小鼠IL-2、IL-4、IL-5、IL-10 mRNA表達水平比較

本研究發現3組實驗組小鼠血清E2水平均明顯低于對照組，自然絕經組CD4/CD8比值低于對照組，差異均有統計學意義；手術去卵巢組、藥物去卵巢組與對照組CD4/CD8比值比較差異均無統計學意義。Kogut等[11]報道CD4/CD8比值倒置是機體免疫缺陷的表現；而Hadrup等[12]報道女性的死亡率增加與CD8+記憶T細胞的數量增多有關，本研究手術去卵巢組、藥物去卵巢組與對照組CD4/CD8比值比較差異均無統計學意義，與前期實驗結果不一致[13]。

Han等[14]報道老年人的B細胞功能不足還表現在受體多樣性的削弱、對抗原反應的下降、對抗體親和力的降低，進而導致體液免疫下降及外源性自體抗原抗體特異性轉變，最終導致自身免疫性疾病如動脈粥樣硬化、糖尿病和阿爾茨海默病[15]。本研究3組實驗組小鼠血清IgM、IgG水平均明顯低于對照組，手術去卵巢組小鼠血清IgM、IgG和IgA水平均低于藥物去卵巢組和自然絕經組，差異均有統計學意義。筆者認為，在手術去卵巢組中E2的急劇減少將更有可能抑制體液免疫功能，更有效地治療E2相關的自身免疫性疾病。

IL-2能夠促進T細胞、B細胞的分化、成熟和增殖，還能促進Tc細胞的活性并轉化為腫瘤浸潤淋巴細胞，增強T細胞介導的免疫應答和NK細胞的免疫應答。IL-4能夠促進巨噬細胞提呈抗原和殺傷腫瘤細胞的功能，IL-5能夠促進B細胞分化與生長、誘導嗜酸性粒細胞分化、促進IgA合成和誘導細胞毒T細胞（CTL）的生成。本實驗發現3組實驗組小鼠IL-2、IL-4、IL-5 mRNA表達水平均明顯低于對照組，差異均有統計學意義；各組小鼠IL-10 mRNA表達水平比較差異無統計學意義。提示老齡化小鼠體內IL-2、IL-4、IL-5升高可能由E2缺乏所致，而E2對IL-10水平作用有限。

綜上所述，Con-A刺激后E2缺乏狀態下年輕與老齡化小鼠之間細胞因子模式是有所不同的，3組實驗組IL-2、IL-4、IL-5 mRNA 表達水平升高，IL-10 mRNA 表達水平無明顯變化，提示老齡化小鼠體內升高的IL-2、IL-4、IL-5可能由E2缺乏所致，而E2對IL-10水平作用有限。自然絕經組CD4/CD8比值下降，IgM、IgG和IgA抗體水平在手術去卵巢組最低，藥物去卵巢組中所有的免疫參數的變化較小。這些結果表明E2缺乏可能只是老年人容易發生免疫缺陷的部分原因，至于老年人免疫功能改變的真正原因一直是討論和研究的焦點。

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