植物抗寒性基因研究綜述

王慶杰 王立

[摘 要]綜述了在低溫脅迫下，植物不飽和酶基因，脯氨酸和甜菜堿的調節及其基因表達，Ca2+及鈣依賴的蛋白激酶對植物抗寒性反應中的調節，抗氧化酶，植物冷誘導基因，植物抗凍蛋白基因工程的研究進展。

[關鍵詞]植物；抗寒基因；表達

[中圖分類號]Q945.78 [文獻標識碼]A

在低溫脅迫下，植株的細胞結構會受到傷害，而且會引發物質代謝紊亂，甚至引起死亡，在農業以及林業生產中造成重大的損失。據統計，世界每年因植物凍害造成的損失達2000億美元左右。隨著分子生物學的發展，導入外源基因已經成為提高植物抗逆性的主要手段。因此，對植物抗逆性基因的研究，無論在理論上還是實際生產中，都有廣泛的應用價值。本文綜述了近年來抗寒性基因工程的研究進展。

1 植物不飽和脂肪酸酶及基因

Levitt，Paha等以及Orvat指出，冷害首先發生在細胞膜和與細胞膜相關的過程。在冷脅迫下，植物的膜系統會發生相變，膜脂從液晶相變為凝膠相，使膜發生收縮，使鑲嵌于膜上的膜蛋白（酶）被固定，酶系統遭受到破壞，膜上出現孔道或龜裂，細胞膜的主動運輸和選擇透過的特性喪失，膜透性增大，因此使膜內可溶性物質、電解質大量向膜外滲透，破壞了細胞內外的離子平衡。膜系統的穩定性直接影響光合和呼吸作用的活性。因此，低溫首先引起膜系統的透性和活性的變化，從而使光合作用減弱，體內的保護系統受到破壞，呼吸速率大起大落，同時細胞間冰晶對細胞膜和細胞壁產生機械損傷，水分平衡受到破壞，最終導致植物死亡。

影響植物膜質脂肪酸飽和性的酶主要有兩類，一類是膜質脫飽和酶，另一類是脂酰轉移酶。

在低溫下，膜質脫飽和酶可以被誘導表達，從而提高植物在低溫下的不飽和度，增加膜系統的穩定性。在已研究的膜脂脫飽和酶基因中fad4、fad5、fad6、fad7、fad8、desC和des9有控制葉綠體中脂肪酸的脫飽和作用；fad2和fad3控制內質網的脂肪酸脫飽和作用。desC基因編碼△9酯酰脫飽和酶，催化已經酰化到甘油C-1位置的硬脂酸在9號碳的位置形成第1個雙鍵。轉化大腸桿菌和煙草試驗表明，desC基因轉化可提高轉化體的不飽和度，增強抗寒性。fad3、fad8、fad7編碼的蛋白為w-3脂肪酸脫飽和酶，他們催化亞油酸脫飽和作用，形成a-亞油酸，轉化w-3脂肪酸脫飽和酶可以提高轉化植株三不飽和脂肪酸含量，提高了植物的抗寒性。

2 脯氨酸和甜菜堿的調節作用及其基因表達

大量的研究揭示，在低溫脅迫下，植物細胞會出現水分虧缺和滲透脅迫，作為滲透調節劑和滲透保護劑的脯氨酸、甜菜堿及糖醇等相容性溶質的積累，是植物響應低溫脅迫的一個重要機制。其中，脯氨酸和甜菜堿是分布最普遍和效應最廣泛的兩種。

幾乎所有的高等植物，在低溫脅迫下，都會發生脯氨酸的大量積累。只是不同的種類和品種間有差異，有的增加幾倍，有的增加幾十倍、上百倍不等。研究表明，隨著脯氨酸的含量的增加，植物的抗逆性也增加。總之，細胞內脯氨酸積累與植物體抗逆性的增強的密切關系，已為許許多多的研究結果所確實。

研究表明，抗凍性極強的高山雪蓮在人工控制的2℃ 低溫鍛煉過程中，脯氨酸合成酶基因的表達水平也提高，導致脯氨酸的積累增加，幼苗的抗凍性也增加。番茄培養細胞在水分缺虧條件下迅速積累脯氨酸水平比對照正常條件下高300倍。

甜菜堿也是一種極好的相容性溶質。它有很多種類型，甘氨酸甜菜堿（glycine betaine，GB）是其中的一種代表型。甜菜堿的積累可顯著提高植物的抗寒性，如將COD基因轉入擬南芥，使其中的甜菜堿高積累達到1.2umol/gFW以上，可提高擬南芥的抗寒性。將BADH基因轉入煙草、小麥和草莓中，實驗表明轉基因植物的BADH增高，其抗寒性和抗鹽性均增強。

有研究指出，當大麥幼苗水分虧缺或鹽脅迫時，甜菜堿和脯氨酸同時以相似的速度在葉片積累，但當脅迫解除后，二者的降解速度卻十分不同，葉片和根中脯氨酸含量迅速下降，而甜菜堿的含量保持基本穩定。這說明，脯氨酸的積累是植物對脅迫的暫時性反應，而甜菜堿的積累則是有一定時間的持久性。甜菜堿代謝緩慢的特點，表明代謝主要是由其合成酶所調控，而脯氨酸的迅速代謝則是受其合成酶和降解酶兩個方面調節，在脅迫時，降解酶被抑制；當脅迫解除，降解酶立即活化，因而含量迅速減少。

3 植物冷誘導基因及轉錄因子CBF

植物冷誘導基因是種誘發基因，只有在一定的條件下，才能被誘發表達（主要為低溫和短日照）。有些基因專一性地受低溫誘導表達，可稱之低溫專一誘導基因； 而有些基因不僅受低溫誘導，還能被ABA、短日照、水分脅迫等誘導，這樣的誘導基因又可稱為冷調節基因。

在最近的幾十年中，已經有很多經過低溫脅迫的誘導表達的抗寒性基因從植物體內分離得到。如擬南芥中，冷誘導基因-Cor基因，又稱為Lti或rd或Kin基因，研究較多的是Cor15、Cor6.6和Cor78；油菜的BN28和BN15，這兩個冷誘導基因分別與擬南芥的Cor6.6和Cor15同源，苜蓿的cas18和cas15基因，菠菜的cap基因，馬鈴薯的PA13基因，小麥的Cor39、WCS120和WCS200基因等。

在擬南芥對低溫和干旱脅迫反應的啟動子分析中，Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki（1994）證實，冷調節原件是一種保守序列9bpTACCGACAT組成，其核心序列為5bpCCGAC，也稱C-repeat/TRE，這個調節原件可對低溫響應。該序列在其他抗寒基因的序列中也發現了，包括擬南芥的COR15a，油菜的BNII5，小麥的WCSI20。要研究調控的分子機理必須分離出編碼C-repeat結合蛋白的cDNA—CBF1。CBF1可結合到CRT/DRE的DNA調控基序上，它的分子質量為24kDa，含有一個AP2區域，其中有一個DNA結合區段。就目前已知的CBF家族中包括有CBF1，CBF2，CBF3，CBF4。由于CBF1-3基因除了具有抗寒作用外，還有抗旱性。所以它們又被分別稱為DREB1b，DREB1c，DREB1a。

CBF/DREB1基因能在冷脅迫下迅速且瞬間表達，它的產物可以激活它下游的各種脅迫反應的靶基因表達。所有的Cor基因的啟動子都帶有CRT/RDE調節元件，可與轉錄活化因子CBF-結合，可刺激Cor基因的表達。Jaglo-Ottosen等（1998）培育出能夠超表達CBF1的擬南芥，使得整套的Cor基因（Cor6，Cor15a，Cor47，Cor78，KN1，ERD10等）在沒有低溫誘導下也能表達。他們通過細胞膜電解質滲透實驗測定，發現超表達CBF1的植株抗寒性比只表達Cor15a植株的抗寒性高3.3℃；CBF1的超表達還能提高植株的冰凍存活率，而只表達Cor15a植株則不能。有研究表明，Cor15a基因表達產物15kDa多肽在輸入葉綠體基質片層中后，被加工成9.8kDa的成熟多肽。在轉基因的擬南芥植株中，Cor15a的表達，可以增強葉綠體的抗寒性，從-4～-8℃增加到-6～-10℃。

4 Ca2+及鈣依賴的蛋白激酶對植物抗寒性反應中的調節

大量的研究表明，Ca2+是低溫下參與信號轉導途徑的第二信使，參與信號的傳遞。在低溫脅迫下，細胞內的Ca2+水平增加。Ca2+可和CaM結合形成Ca2+-CaM復合物，使CaM活化，介導細胞內各種依賴Ca2+的生理生化過程。Ca2+-CaM可直接作用于效應系統，如激活質膜和液泡膜上的Ca2+-ATPase，使增加的Ca2+撤退。另一方面，Ca2+-CaM可磷酸化級聯反應將信號傳遞各下游脅迫響應基因，調控這些基因的表達和產物的活化，使植株的抗寒性增加。

在由低溫引起的Ca2+流入和抗凍基因的表達中，植物鈣依賴的蛋白激酶（caIciurn dependent protein kinases，cDPKs）的轉錄水平增高，cDPKs的激酶活性被進一步激活。

Ray等的研究發現，在低溫、干旱、鹽脅迫條件下，水稻中31個CDPKs基因中有6個基因受脅迫誘導表達量上升，1個基因受脅迫刺激表達量下降。Wan等對11個水稻CDPKs基因在干旱、低溫、高鹽和稻瘟病菌浸染等脅迫和激發子處理條件下的轉錄表達分析表明，每個基因至少受2種脅迫誘導而產生2倍以上水平的表達變化。在正常環境條件下，水稻OsCDPKs7基因轉錄水平很低，在10d齡的水稻小苗中檢測不到mRNA的積累，但當經過鹽脅迫或低溫處理8～24h后，OsCDPK7基因mRNA表達量大量增加。OsCDPK13基因受低溫誘導表達上升，并且在耐低溫品種中的表達量高于在低溫敏感品種中的表達量。OsCDPK7基因表達量越高轉基因水稻對脅迫的耐性就越強。同時，OsCDPK7基因的超表達增強了salT、rabl6A等脅迫響應基因在鹽脅迫條件下的誘導。這表明OsCDK7基因可能就是調控salT、rabl6A 等下游脅迫響應基因來參與水稻對鹽脅迫的耐性反應。但在低溫脅迫下不能誘導這些基因的表達。這些結果表明OsCDPK7基因同時參與了水稻低溫和鹽脅迫反應的信號轉導，但水稻對低溫脅迫與鹽脅迫的響應是兩條不同的信號途徑。

在低溫下，Ca2+的增加還可促進脯氨酸的積累，這一現象已在Amarathus和番茄幼苗及培養細胞實驗中證實。Ca2+還可調節冷誘導基因的表達。可見，Ca2+ 在植物細胞對低溫反應中起著一個中心的關鍵性調節作用，對植物的抗寒性有著極其重要的作用。

5 抗氧化酶基因

活性氧（reactive oxyen species，ROS）是生物體有氧代謝產生的一類活性含氧化合物總稱，包括有超氧陰離子（O2-），過氧化氫（H2O2），羥自由基（.OH），單線態氧（1O2）等。高濃度的活性氧幾乎能與所有細胞成分發生反應：破壞蛋白質結構，嘌呤氧化，并引起脂質的過氧化，導致膜結構破壞。

許多研究表明，外界環境的脅迫，包括低溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫會導致ROS的發生和抗氧化系統間的動態平衡的破環。在這些逆境中，如寒凍脅迫過程中，自由基將會積累，從而造成植物細胞脂質過氧化，從而引發一系列的植物細胞的損傷。植物的抗氧化系統能夠穩定膜結構，調節膜透性。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等，這些物質協同作用以去除植物體內的活性氧自由基，尤其以SOD最為重要，它是植物體內清除活性氧的關鍵抗氧化酶。

Gupta等將外源Cu/Zn-SOD基因導入煙草中，轉化株的葉綠體中SOD 超表達，SOD酶的活性升高，同時清除APX 活性也升高，從而增加了煙草抵抗低溫引起發光抑制的能力。

6 植物抗凍性蛋白（植物AFP）

AFP是一種適應低溫的特異蛋白質，它能阻止體液內冰核的形成與生長，維持體液的非冰凍狀態。了解其特征和抗凍生理機制對農作物抗凍品種選育有重要意義。

AFP是一種低溫誘導蛋白，胡蘿卜的AFP基因在非冷馴化狀態下不表達，而在冷馴化狀態下表達水平迅速呈特異性地提高。轉基因植物的AFPs通常只在低溫（4℃）誘導下才能檢測到其表達。更值得一提的是，AFPs有親水性和熱穩定性，這也與冷誘導蛋白相似。

Griffith等第一次明確提出獲得了植物內源AFPs，他們從經過低溫鍛煉的可以忍受胞外結冰的冬黑麥葉片質外體中得到并部分純化了抗凍蛋白。同年，美國圣母大學的Duman實驗室在多種植物中發現了具有熱滯效應的蛋白質。1994年我國學者費云標等從常綠抗凍植物沙冬青（Ammop ip tanthus monglicus） 葉片中分離得到了抗凍蛋白的蛋白質。

AFP不僅存在于被子植物中，且裸子植物、蕨類植物及苔蘚植物中均發現有抗凍活性的特異蛋白質。另外低等植物包括真菌和細菌中也存在AFP。已研究的絕大多數植物材料中AFP活性大大低于魚類和昆蟲，所研究的植物雖多達幾十種，但真正被分離純化出來的AFPs尚不多，據報道冬季常綠喬木北海道黃楊能忍耐-23.9℃低溫，若能從其中提取出抗寒基因并轉入其他植物，無疑將極大地提高轉基因植株抗寒性，因為植物內源AFPs基因更適合在植物體內表達。因此如何從植物中分離出更多的、活性更高的AFP，并通過遺傳轉化將其導人抗寒性弱或不抗寒植物中進而獲得抗寒性強的轉基因植株，將是今后植物抗寒性基因工程研究的主要內容之一。

若能夠很好地將植物抗寒性基因的研究應用于寒冷地區林業植物以及農業植物的栽培當中，我們將會在林業栽培以及農作物種植方面取得極大的進展。

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