舟山東極海域冬、夏季微型真核浮游生物優勢種相關環境因子分析

程傳東 趙淑江

[摘要]為了加深對舟山東極海域微型真核浮游生物優勢物種與相關海洋環境因子之間相關性的了解。于2016年6月和2017年2月采取夏季和冬季兩季海水樣品。通過過濾濾膜收集海水中3～20μm的浮游生物。基于18S rDNA進行高通量測序得到相關數據，并利用SPSS17.0相關性分析探討海洋生態因子與微型真核浮游生物之間的關系。微型真核浮游生物群落組成在各個站位之間不盡相同，但都主要包括Cryptomonadales、Ciliophora、Ascomycota三大優勢物種。SPSS相關性分析結果表明微型真核浮游生物群落結構和多樣性情況與所在站位的環境因子息息相關，夏季優勢物種主要由Ascomycota、Ciliophora組成，冬季優勢物種主要由Cryptomonadales組成。

[關鍵詞]舟山東極海域；微型真核浮游生物；相關分析；環境因子；優勢度

[中圖分類號]Q178 [文獻標識碼]A

微型真核浮游生物通常是指粒徑在3～20μm之間的真核浮游生物，是構成海洋微型食物鏈和生物量的重要組成部分，在海洋生態系統中占有十分重要的地位。隨著顯微技術、分子生物學等新的技術手段被越來越廣泛地應用到海洋浮游生物領域，人們發現了以前未知的個體微小的真核生物。許多微型真核浮游生物無明顯的外部特征，大多呈球形或近球形，準確鑒定其種類仍存在很大的困難。微型浮游生物的研究最早始于英國，直到近幾十年來，基于現代觀測技術和實驗技術的進步，微型浮游生物的研究才逐漸得到更多重視并且有了較快的發展。目前我國對海洋微型真核生物的研究主要集中于時空分布和豐度檢測層面，對其分子多樣性研究仍頗為匱乏。微型真核浮游生物作為初級生產者、細菌捕食者和較大型生物寄生者，在維持生態系統穩定和群落結構多樣性中起核心作用。因此，研究微型真核浮游生物對舟山海域水生生態系統中的物質循環和能量流動有著重要意義，有助于更多地了解水體中微生物網的結構和功能。

本研究以分子生物學技術為研究方法，基于高通量測序手段，揭示目標海域的微生物群落多樣性情況，同時應用SPSS17.0統計學軟件對其數據進行相關性分析，探索海洋真核微型浮游生物群落結構與環境因素之間的關系，對微型真核浮游生物的環境影響因素進行討論。本研究將為進一步了解海洋真核微型浮游生物群落結構及多樣性提供了分子生物學層面的數據支持，并對微型真核浮游生物可作為一些經濟魚類的餌料持樂觀預測，值得研究者們的深入研究。

1 樣品采集及預處理

2016年7月及2017年2月在舟山東極海域設置6個代表性站位采集夏、冬兩季的海水樣品，共12個海水樣品，各采樣站位坐標分別為S1（122.6982，30.1953）、S2（122.6973，30.2021）、S3（122.6956，30.2064）、S4（122.6953，30.2125）、S5（122.6921，30.2191）、S6（122.6869，30.2285）。夏季樣品名分別是X1、X2、X3、X4、X5、X6，冬季樣品名分別是D1、D2、D3、D4、D5、D6（見圖1）。

1.1 生態因子及微型浮游生物樣品采集

在水樣采集站點，利用便攜式 HQ-30D 溶氧儀立即測定各采樣站點的溶解氧（DO）和水溫（Temperature），用便攜式鹽度計測定鹽度，用記錄表單記錄下來；各站點分別采集表層（0.5 m）海水并經過腳踏式真空抽濾裝置（富林004）進行抽濾，先后經過20μm和3μm混合纖維素濾膜（Millipore公司）分子膜過濾，富集海洋細菌于膜上，然后把過濾后的分子膜放置于凍存管中并立即加入終濃度為0.5%的戊二醛混勻固定。再放入液氮罐中保存并帶回實驗室，然后轉移到-80 ℃超低溫冰箱保存直到實驗開始。

1.2 DNA的提取及檢測及PCR擴增

取出保存分子膜的凍存管并在常溫下待其解凍，在無菌的條件下剪碎。采用水體DNA試劑盒（OMEGA Water DNA Kit：D525-01）進行提取，DNA提取完成后用紫外分光光度計（NANO Drop 2000）檢測其濃度和純度，合格后進行PCR擴增，采用擴增引物（SSU0817F_SSU1196R），PCR反應體系為95 ℃預變性3 min，95 ℃30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環35次，72 ℃延伸7 min。采用20 ul反應混合液，擴增產物用2%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。將DNA樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司在Illumina MiSeqTM 平臺上進行高通量測序。為了提高分析結果的質量，按照97%相似性進行OTU聚類。還可以提供環境因子，進行相關性分析。

2 結果

2.1 東極海域微型真核浮游生物優勢物種組成

通過測序后所得數據可以發現以下規律：東極海域總體微型真核浮游生物種類數量較多，每個站位的真核微生物種類比較繁多且不盡相同，但同季節各站位微型真核浮游生物優勢物種相似性較大。如冬季優勢物種：Cryptomonadales、Ciliophora，在各站位所占比例處于85.8%～90.7%之間；夏季優勢物種：Ascomycota在各站位所占比例處于59.9%～94.6%。由表1和表2可以發現，以上三種優勢物種無論冬季還是夏季都占據著前三的平均優勢度，特別是冬季的Cryptomonadales以及夏季的Ascomycota，都占據著絕對的優勢比例。因此可以說明，這三個物種在該海域微型真核浮游生物中占據著主導地位（見表1和表2）。

2.2 豐度及多樣性

從OTU聚類結果來看，本次實驗共得到42個門（phyla），69個綱（Class），193個目（order），115個科（family），138個屬（genus）。本文通過測序在門水平做出了群落的Heatmap圖，該圖可以通過顏色梯度及相似程度來直觀的反映多個樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性，可以比較直觀的展現出各個站位的物種的相對豐度及多樣性的情況（見圖2），圖中顏色越深說明該細菌門類豐度越高。在門水平下，冬、夏兩季的物種組成比例差異相對明顯，從其中可以清楚地看出所占比例較大的有三類物種：Cryptomonadales、Ciliophora、Ascomycota。明顯地，夏季的Ascomycota豐度最高，冬季則是Cryptomonadales豐度最高，其次是Ciliophora。

2.3 微生物與環境因子相關性分析

采用SPSS17.0統計軟件，篩選出生物量相對較多的幾種優勢種的生物量與水溫（T）、溶解氧（Do）、PH值、鹽度（Salinity）四個環境因子進行Person相關性分析，結果表明：（1）該海域微型真核浮游生物優勢種與所列環境因子相關性不盡相同。從表3中可以看出，優勢種Ascomycota只與T環境因子為極顯著正相關，與Do和Salinity為極顯著負相關，與其他物種呈極顯著負相關（P<0.01），Ascomycota、Ciliophora兩個優勢物種都與PH和Do呈極顯著正相關，與T呈極顯著負相關（P<0.01）；環境因子之間PH與Do呈極顯著正相關，與T呈極顯著負相關，Do與T呈極顯著負相關（P<0.01）；各參數指標間的相關系數見表3。

3 討論與結論

3.1 舟山東極海域海洋微型浮游生物優勢物種的豐度影響分析

由上述研究可知，舟山東極海域冬、夏兩季微型真核浮游生物優勢物種主要有3種，都在各自季節占據著絕對的比例，分別為Cryptomonadales、Ciliophora以及Ascomycota。但不難發現，冬季優勢物種Cryptomonadales和Ciliophora在各站位所占比例處于85.8%～90.7%之間，變化區間不大，有力地說明了該兩物種在該海域的優勢地位，而夏季優勢物種Ascomycota在各站位所占比例處于59.9%～94.6%，變化幅度較大，從1站位的94.6%到6站位的59.9%，表現出了該優勢物種豐度的變化較大，而從1到6號站位大致是從近岸到遠岸，可能這些距離也導致著站位間的海水生態環境的不同，間接地影響了夏季該優勢物種的豐度值。舟山東極海域蘊含著較為豐富的微型真核浮游生物群落，為全面認識舟山功能海域中真核微生物多樣性奠定基礎。

3.2 真核微型浮游生物多樣性與環境因子之間的關系

微型真核浮游生物與環境變量之間有著相互影響、相互支撐的作用，每片海域定然會有著不同的海域環境，因此其環境因子也會相應的有所不同，進而影響著不同海域微生物多樣性的程度。比較常被引用的環境因素主要包括溫度、鹽度、DO和無機營養鹽等。在本研究中，毫無疑問，溫度環境因子是我們考慮的首要因素，選擇冬夏兩季也是由此而來。相關系數矩陣中所得出的結果也與實際情況相符，兩季的樣品很明顯地呈現出負相關，與夏季樣品有著極強的相關性的環境因子有Do、PH，而與冬季樣品表現出較強的相關性的環境因子有Salinity和T。其中，Salinity環境因子與這些優勢種無顯著相關，影響較小。

綜上，舟山東極海域的微型真核浮游生物優勢種在冬夏兩季雖有差異，但都有較為豐富的多樣性；同時在環境影響因子方面，本文只選用了四個相對比較常用的且影響力比較明顯的環境因子，因此該海域環境因子的相關分析也值得學者們的進一步研究，而目前有關東極海域微型真核浮游生物的相關研究甚少，所以本研究也可以為研究者們的進一步研究提供一些數據及經驗上的幫助，目前的分子生物學技術迅速發展，如本研究所使用的高通量測序等，可以為研究者們提供效率高、成本較低、數據準確的先進技術，使海洋微生物的研究能夠更好地發展。

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