干擾MITF表達對惡性黑素瘤細胞B16F10增殖及黑素生成的影響*

陳恒君，田超群，楊鈺興，袁睿（重慶市渝北區人民醫院：.皮膚科；.泌尿外科400）

惡性黑素瘤是由皮膚、黏膜、眼等色素沉著部位的黑素細胞產生的一種高度惡性腫瘤，其特點為生長隱匿、轉移早且迅速，患者預后差及病死率高，致死率達79.0%[1?3]。目前，已確定小眼畸形相關轉錄因子（MITF）在黑素細胞和黑素瘤細胞核中高表達[4?5]，是核蛋白最重要的轉錄因子，具有較強的診斷靈敏度和特異性[6?7]，但相關機制研究較少。本研究采用RNA干擾技術，研究了MITF對惡性黑素瘤的生長及黑素生成能力的影響，試圖為惡性黑素瘤的治療提供新的思路和策略，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 pLKO.1?短發夾RNA（shRNA）載體。

1.1.2 細胞系 B16F10黑素瘤細胞系購自KeyGen公司。細胞生長基質（培養液 1）為 RPMI?1640、10% 胎牛血清。細胞培養箱條件為37℃及5%二氧化碳。

1.1.3 主要試劑 RPMI?1640、10%胎牛血清均購自HyClone公司；mRNA提取試劑盒Trizol Reagent、逆轉錄試劑盒 PrimeScript?RT reagent Kit、擴增試劑盒SYBR Green RT?PCR Kit均購自 TaKaRa公司；蛋白抽提試劑盒、蛋白質印跡跑膠試劑盒、聚偏氟乙烯（PVDF）膜、蛋白質印跡顯影ECL化學發光試劑盒、Tri?ton?X100、MTT細胞活性檢測試劑盒均購自Beyotime公司；蛋白定量試劑盒采用Pierce?BCA Protein Assay Kit，購自Thermo Scientific公司；免疫組織化學試劑盒購自博士德公司；MITF、β?actin蛋白抗體均購自Santa公司；DNA Marker、RNA Marker、LipofectamineTM2000均購自Invitrogen公司；嘌呤霉素購自Sigma公司；MITF?shRNA質粒由KeyGen公司構建，并根據片段不同分別標注為 B16F10?NC（空白質粒對照）、B16F10?1、B16F10?2、B16F10?3，另建立未用任何質粒轉染的陰性對照（B16F10組）。

1.2 方法

1.2.1 構建穩定干擾MITF表達的B16F10細胞系 將對數生長期B16F10細胞系傳代并過夜（約24 h）培養，按標準流程，使用LipofectamineTM2000將擴增的shR?NA質粒中MITF沉默片段轉染該細胞系。48 h后，使用添加嘌呤霉素（4μg/mL）的細胞培養液（培養液2）繼續培養轉染細胞系2周（每2～3天更換1次培養液2），將存活細胞單克隆移至96孔板中并使用培養液2繼續培養，直至轉染細胞系呈對數期生長并達90%以上的匯合率時將孔中細胞轉移至培養瓶中使用培養液3（嘌呤霉素降至2μg/mL）繼續培養并大規模傳代以收集細胞系進行研究。每傳代5～7次時再次使用培養液2進行篩選。

1.2.2 RNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測MITF基因表達 按說明書使用Trizol Reagent提取總RNA，用分光光度儀（A260/280）測定總RNA，并按說明書使用PrimeScript?RT reagent Kit制備cDNA。MITF上游引物：5′?CGGGTCTCTGCTCTCCAGA?3′，下游引物：5′?CCGGCTGCTTGTTTTGGAA?3′。按下述方法配置 25μL 反應液：（1）SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ（2×）12.5 μL；（2）PCR 上游引物（10 μmol/L）1 μL；（3）PCR下游引物（10 μmol/L）1 μL；（4）DNA 模板 2 μL（＜100 ng，且液體量不超過反應液總體積的10%）；（5）dH2O 8.5μL。擴增反應條件：（1）預變性為 95℃、30 s，1次；（2）PCR 反應為 95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40 次；（3）溶解。1.2.3 蛋白提取及蛋白質印跡檢測MITF蛋白表達 收集對數生長期細胞，在4℃條件下使用蛋白抽提試劑盒裂解細胞并收集蛋白；使用Pierce?BCA Protein Assay Kit按標準流程測定收集的總蛋白。根據測定結果按40μg的總蛋白量加樣、檢測、跑膠、轉膜及顯影。圖像采集使用化學成像系統（ChemiDoc XRS+，Bio?Rad，USA）。圖像分析采用Quantity One4.6軟件。內參使用β?actin蛋白。

1.2.4 黑素含量測定 （1）細胞外分泌黑素含量測定：使用不含酚紅的培養基在常規條件下培養細胞24 h并收集培養基（溶液1）；（2）細胞內分泌黑素含量測定：收集上述去除培養基的細胞，使用蛋白抽提試劑盒提取蛋白，離心500 r/min，上清液（溶液3）進行總蛋白測定，收集下層黑色固體物質與1 mol/L的NaOH溶液在60℃條件下孵育2 h并充分溶解（溶液2）。使用分光光度計在405 nm處測定黑素溶液1及溶液2中黑素含量。按每種細胞蛋白濃度標準化每種細胞內外黑素含量[8]。

1.2.5 酪氨酸酶（TYR）活性及 TYR/TYR?1/TYR?2蛋白檢測 按下述方法配置溶液：（1）溶液A，配制含2%N，N?二甲基甲酰胺的磷酸鈉（100 mmol/L，pH 7.1）；（2）溶液 B，配制含 5 mmol/LL?左旋多巴的磷酸鈉（100 mmol/L，pH 7.1）；（3）溶液 C，配制含 20 mmol/L 的酚試劑去離子水。在細胞中加入0.5%Triton?X100（含1%脫氧膽酸鈉）并孵育2 h裂解細胞，再按2∶1∶1比例加入溶液A、B、C，在37℃條件下反應10 min，然后在分光光度計下測定505 nm處吸光度。與1.2.4項相同，按每種細胞蛋白濃度標準化每種細胞的蛋白含量。

1.2.6 細胞增殖活性檢測（克隆形成實驗、MTT實驗） 取對數生長期細胞并計數，按每孔500個細胞接種于96孔板中（每種細胞重復5個孔），加入培養基并在細胞培養箱中培養48 h，加入MTT溶液（5 mg/mL）10μL，繼續在細胞培養箱中孵育4 h，再加入甲臜溶解液100μL后繼續在細胞培養箱中孵育，直至結晶全部溶解，最后使用分光光度計測定570 nm處吸光度。

1.3 統計學處理 應用SPSS18.0統計軟件進行數據分析，組間和組內比較采用單因素方差分析（One?Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組MITF基因及蛋白表達水平比較 與B16F10組比較，B16F10?1組MITF基因干擾效率最大（達82.7%），B16F10?2、B16F10?3 組 MITF 基因干擾效率分別為 62.3%、21.5%；B16F10?1、B16F10?2、B16F10?3 組基因表達水平與B16F10組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。與 B16F10 組比較，B16F10?1 組MITF蛋白表達水平最低，干擾效率最高（50.0%），B16F10?2、B16F10?3 組蛋白表達干擾率分別為 22.1%、11.6%；B16F10?1 、B16F10?2、B16F10?3 組基因表達水平與B16F10組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），與MITF基因表達水平基本一致。見圖2。表明B16F10?1為首選目標細胞系，其次為B16F10?2。

圖1 各組MITF基因表達水平比較

2.2 各組增殖活性比較 與B16F10組比較，B16F10?NC組細胞增殖活性無明顯改變，差異無統計學意義（P＞0.05）；B16F10?1組細胞增殖活性降低最明顯（達49.5%），B16F10?2組細胞增殖活性也有所降低（達23.8%）；B16F10?1、B16F10?2 組細胞增殖活性與 B16F10 組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

2.3 各組細胞內外黑素含量比較 B16F10?1組細胞內外黑素含量降低最明顯（分別為49.7%、43.8%），B16F10?2組細胞內外黑素含量降低程度分別為21.4%、16.8%；B16F10?1、B16F10?2 組細胞內外黑素含量與B16F10組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），但B16F10?NC組細胞內外黑素含量均無明顯改變，與B16F10組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），與MITF基因和蛋白表達趨勢一致，見圖4。

圖2 各組MITF蛋白表達水平比較

圖3 各組增殖活性比較

圖4 各組細胞內外黑素含量比較

2.4 各組TYR活性比較 與B16F10組比較，B16F10?1組TYR活性降低最明顯（達48%），B16F10?2組TYR活性降低了 29.0%，B16F10?1、B16F10?2 組 TYR 活性與B16F10組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組TYR活性比較

3 討 論

目前，已確定MITF選擇性表達于黑素細胞和黑素瘤細胞核，是黑素細胞的核蛋白和最重要的轉錄因子，在黑素細胞生成和活性方面具有關鍵性作用。目前，已證實該基因在黑素細胞起源細胞（如黑素母細胞、黑素細胞及黑素瘤細胞）中參與了形態、分化和生存的調節[7，9]；而在黑素瘤患者中該基因處于失調狀態[6]，是一種診斷黑素瘤靈敏度和特異性均較強的免疫標記物[7]。

MITF在黑素細胞中特異表達，是調節黑素細胞發育的關鍵轉錄因子和總調控因子，參與了黑素細胞形態構成、黑素合成、轉運和運輸。MITF主要通過調控黑素細胞中特異表達基因TYR的轉錄活性調節黑素分泌，TYR參與并調控黑素合成，是黑素生成的關鍵酶[10]。

本研究以MITF為靶基因，利用RNA干擾技術特異性抑制該基因及蛋白表達，觀察B16F10黑素瘤細胞增殖活性變化，進而探討MITF對黑素瘤細胞內外黑素分泌水平的影響及與該分泌水平密切相關的TYR活性的影響，從而驗證MITF高表達在黑素瘤細胞中的關鍵作用。結果顯示，RNA干擾技術能在B16F10細胞中顯著抑制MITF基因及蛋白表達，最高干擾率分別達82.7%、50.0%；MTT實驗結果顯示，干擾MITF表達能顯著抑制B16F10細胞增殖活性，表明MITF對黑素瘤細胞增殖活性具有重要作用。與VACHTENHEIM等[11]研究結果一致。本研究B16F10細胞內外黑素含量測定結果顯示，干擾MITF表達能顯著抑制黑素瘤細胞內外黑素分泌水平；TYR活性測定結果顯示，干擾MITF表達也抑制了與黑素分泌水平密切相關的TYR的活性，表明MITF對黑素瘤細胞中的TYR活性及黑素生成均具有重要作用，與黑素瘤細胞中的黑素功能密切相關。

目前，較一致的看法是MITF在黑素細胞的黑素生成和活性方面均具有關鍵性作用。本研究結果不僅證明了MITF對黑素瘤細胞的增殖具有重要作用，更進一步證明了MITF在黑素瘤細胞黑素生成及活性調節方面發揮了關鍵性作用。為了更深入的研究，包括MITF如何調節黑素瘤細胞的增殖活性及黑素生成的活性，以及上、下游基因和相關信號通路等研究奠定了重要的實驗基礎，從而為惡性黑素瘤的治療提供了新的思路和策略。

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