芪參益氣滴丸預適應對缺氧復氧損傷心肌細胞的延遲保護作用及與 H SP70的關系*

馬 妍 ，郭利平 ，樊官偉 ，任 明 ，張 磊 ，王 怡 ，李 巖 ，孫 曉 ，趙宏杰 ，劉 丹

1天津中醫藥大學附屬保康醫院，天津 300193；2天津中醫藥大學；3天津中醫藥大學第一附屬醫院；4天津市武清區中醫醫院

缺血預適應(ischemic preconditioning，IPC)是減輕缺血再灌注損傷的重要措施，缺血預適應的保護效應分為預適應即刻產生且持續2～3小時的早期保護(early protection，EP)和在預適應后12～24小時出現且持續24～72小時的延遲保護(delayed protection，DP)。研究表明，DP對心臟的保護作用包括改善心肌壞死、抗心律失常、保護血管內皮、抗心肌頓抑、保護心肌舒張功能等［1］。相對于EP，DP效應具有較長的保護作用而更具有應用價值。缺血預適應是一種機械性操作，無法避免血管壁損傷、斑塊脫落等風險，因此根據IPC的機制，以藥物激發或模擬機體內源性保護物質以減輕心肌損傷更具有臨床應用價值。相對于西藥在某一環節發揮作用，中藥可以通過多種途徑作用于損傷部位，其有效性更有保障。中藥的DP效應已被研究證實［2］，但對其機制研究尚不充分。DP效應的產生涉及細胞內信號途徑的激活，目前研究認為包括“觸發物質-中介物質-效應子”三個環節［3］。熱休克蛋白70是機體內重要的應激蛋白，在熱休克家族蛋白中表達量最高［4］，熱休克蛋白70是分子量在70KD左右的熱休克蛋白，是缺血預適應DP效應機制中重要的效應子，其對心肌的保護作用可能通過抗凋亡、抗氧化應激、分子伴侶、保護內皮功能、穩定細胞骨架等方面實現［5］。本實驗以缺氧復氧模擬缺血再灌注過程，研究芪參益氣滴丸預適應對心肌細胞的延遲保護作用，以及其機制是否與上調心肌細胞內源性HSP70相關。

1 材料與方法

1.1 試劑 芪參益氣滴丸溶液由天津天士力集團提供中藥浸膏，按一定比例于完全培養基中混合溶解而成。細胞增殖/毒性檢測(CCK-8)試劑盒(同仁化學研究所，日本，Lot.FH783)，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(北京中生生物工程高技術公司，Lot.142715003)，丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，Lot.20140117)，超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所，Lot.20140115)，大鼠 70kDa熱休克蛋白 1A(HSPA1A)檢測試劑盒(Cloud-Clone公司，美國，Lot.D600)，NAC(Sigma 公司，美國，Lot.YT305)，UNIQ-10 column Trizol總RNA抽提試劑盒(生工生物技術服務有限公司，上海，Lot.50175111)，ImPromⅡReverse Transcription System逆轉錄試劑盒(Promega公司，美國，Lot.00322404)，FstaStart Universal SYBR Green Master實時定量 PCR試劑盒(Roche公司，德國，Lot.154041020)。

1.2 儀器 恒溫二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)，厭氧培養箱(美國Thermo公司)，倒置相差光學顯微鏡(德國Leica公司)，新穎立式小容量恒溫搖床(上海世平實驗設備有限公司)，高速冷凍離心機(美國Beckman公司)，全自動生化分析儀(日本日立 7020型)，多功能讀板機(瑞士Tecan公司)，核酸蛋白分析儀(美國Beckman)，PCR-C1000逆轉錄儀(美國Bio-Rad公司)，7500型實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems)。

1.3 心肌細胞原代 出生3天內的Wistar乳鼠，消毒后取心臟，沖洗、剪碎、反復消化，收集上清液，離心，重懸細胞沉淀后接種至培養瓶，差速貼壁培養90分鐘，分離心肌細胞，加入0.1 mmol/L的5-brdu后，放入細胞培養箱［6］。培養3天后，心肌傳代并以2.5×105個/mL的密度種入24孔板和6孔板，48小時后鏡下觀察可見純凈心肌細胞，成簇或單層，同步性搏動，頻率為80～120次/min，細胞狀態良好，可用于實驗。

1.4 實驗分組 本實驗分為空白組(Control)、缺氧損傷組(H/R)、芪參益氣預適應組(QS)、缺氧預適應組(HPC)、缺氧預適應+NAC組(HPC+NAC)、缺氧預適應+NAC+芪參益氣預適應組(HPC+NAC+QS)。

1.5 實驗過程 第一代心肌細胞培養48 h后，換DMEM/F12同步24 h。同步后，各組實驗過程如下：Control組：將培養液置換成全培基(由90%DMEM/F12培養基，10%胎牛血清以及1%雙抗組成)，放入正常培養箱中培養，直到實驗結束。H/R組：將培養液置換成全培基，培養28小時20分鐘后，放入94%N2-5%CO2-1%O2的缺氧培養箱中26小時(缺氧箱內環境達到缺氧條件O2＜1%約需2小時)，取出放入正常培養箱中復氧2 h，結束實驗。QS組：換含芪參益氣0.5 mg/mL的培養液培養1小時，余操作同H/R組。HPC組：將培養液置換成全培基后，放入缺氧培養箱中2小時40分鐘(缺氧箱內環境達到缺氧條件O2＜1%約需2小時)，再取出放入正常培養箱中復氧40分鐘，之后正常培養24小時，余操作同H/R組。HPC+NAC組：換含1 mmol/L的NAC溶液培養30分鐘，后同HPC組操作。HPC+NAC+QS組：換含芪參益氣0.5 mg/mL的培養液培養30分鐘，后加入1 mmol/L的NAC繼續培養30分鐘，后同HPC組操作。注：芪參益氣滴丸溶液的作用濃度及作用時間均根據前期實驗結果確定，為最佳作用濃度及作用時間。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 形態結構觀察 倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。

1.6.2 上清液LDH活性測定 留取96孔板每組細胞培養上清液，以全自動生化分析儀測定上清液中LDH活性。

1.6.3 細胞活力測定 棄去96孔板細胞培養上清，每孔加入 100 μL體積比為1∶10的CCK-8與DMEM/F12的混合液，放入孵箱繼續孵育2 h，于波長450 nm處，測定各孔吸光度(OD值)。

1.6.4 上清液MDA活性測定 留取24孔板培養細胞上清液，以硫代巴比妥酸法測定脂質過氧化物丙二醛(MDA)含量。

1.6.5 上清液SOD活性測定 留取24孔板培養細胞上清液，以WST-1法測定超氧化物歧化酶(SOD)活力。使用酶標儀，測定波長450 nm。

1.6.6 ELISA法測定心肌細胞HSP70蛋白表達 取心肌細胞培養液測定各組HSP70的蛋白濃度。按照大鼠70 kDa熱休克蛋白1A(HSPA1A)檢測試劑盒說明進行操作，用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)，使用專業軟件curve expert 1.30計算出各組樣本實際蛋白濃度。

1.6.7 實時定量PCR法測定心肌細胞HSP70 mRNA表達 按照試劑盒提取樣本心肌細胞的總RNA，檢測RNA的純度及濃度。以提取的總RNA為模板，根據試劑盒操作步驟反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板行PCR擴增反應，檢測HSP70mRNA的相對表達量。引物序列見表1。PCR反應體系：RT-PCR Mix12.5 μL，F-Prime0.5 μL，R-Primer0.5 μL，ddH2O11 μL，cDNA0.5 μL，總體積 25 μL。PCR反應條件：50℃2分鐘→95℃10分鐘→95℃15秒，60℃1分鐘40個循環。每個樣品做3個復孔。實驗數據根據目的基因和內參基因GAPDH的Ct值，采用2-ΔΔCt法計算出各樣本中HSP70 mRNA的相對表達量。

表1 HSP70基因引物序列

1.7 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，定量資料以(±s)表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌細胞形態變化 實驗結束后，在倒置相差光學顯微鏡下觀察，Control組心肌細胞呈網狀，緊密附著在培養皿底部，規律搏動，狀態良好；H/R組心肌細胞大部分萎縮且附著不牢、停止搏動；HPC+NAC組心肌細胞有少部分萎縮且附著不牢，大部分細胞保持網狀形態但停止搏動；QS組、HPC組、HPC+NAC+QS組有少量心肌細胞停止搏動，大部分細胞呈網狀且能夠緊密附著、規律搏動，搏動頻率略下降＜80/min。

2.2 心肌細胞損傷測定結果 與Control組相比，H/R組 CCK-8降低，LDH升高、MDA升高、SOD活力減少(P＜0.05)，說明缺氧損傷模型組心肌細胞活性與抗氧化力減低、損傷嚴重，缺氧損傷模型成立；與H/R組相比，QS組與HPC組CCK-8、SOD升高(P＜0.01或 P＜0.05)，LDH、MDA 減少(P＜0.01或P＜0.05)，說明經過中藥預適應或缺氧預適應的心肌細胞在經過缺氧復氧損傷后仍表現出很好的細胞活性與抗氧化力，損傷輕；與HPC組比較，HPC+NAC組 CCK-8降低、LDH升高(P＜0.01)，MDA呈升高趨勢、SOD活力呈降低趨勢，說明NAC抑制了缺氧預適應對心肌細胞的延遲保護作用，在經過缺氧復氧損傷后細胞表現為活性降低、抗氧化能力減弱，損傷較重。HPC+NAC+QS組分別與HPC+NAC組、H/R組比較，CCK-8增高、LDH降低、MDA降低(P＜0.01或P＜0.05)，SOD活力呈升高趨勢，說明經過中藥與缺氧預適應同時作用的心肌細胞在加入NAC后，細胞仍然可以表現出很好的活性與抗氧化能力，損傷輕。見表2。

2.3 心肌細胞中HSP70蛋白含量與mRNA表達測定結果 Control組與H/R組比較HSP70蛋白含量與mRNA表達差異無統計學意義(P＞0.05)。與H/R組比較，經過中藥或缺氧預適應的心肌細胞HSP70蛋白含量與mRNA表達差異有統計學意義(P＜0.05)，蛋白含量 HPC較 QS組含量略高，HSP70 mRNA表達QS較HPC組表達略高。加入NAC后，缺氧預適應的心肌細胞(HPC+NAC)HSP70蛋白含量及mRNA表達差異有統計學意義(P＜0.05)；而中藥與缺氧預適應同時作用的心肌細胞(HPC+NAC+QS)，HSP70蛋白含量沒有降低反而高于HPC組與QS組，mRNA表達也較HPC組略高，蛋白含量與mRNA均與HPC+NAC組差異有統計學意義(P＜0.05)。總體結果HSP70蛋白含量與mRNA測定基本一致。見表3。

表2 各組QSYQ預適應對缺氧/復氧CM中CCK-8、LDH、MDA、SOD的影響(s)

表2 各組QSYQ預適應對缺氧/復氧CM中CCK-8、LDH、MDA、SOD的影響(s)

注：與H/R組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與HPC+NAC比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01

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表3 各組HSP70蛋白含量及mRNA表達

3 討論

中藥預適應的DP效應在很多研究中已經被證實，本實驗結果中芪參益氣滴丸對缺氧復氧損傷的心肌細胞發揮了延遲保護作用，其作用效果與缺氧預適應基本一致［7］。HSP70可以主動釋放到細胞外，在心肌缺血再灌注損傷的動物模型和臨床心肌損傷的患者血清中均能檢測到高表達的HSP70［8-9］，HSP70 表達量與患者的病情嚴重程度密切相關［10］。以往研究表明，以不同方式誘導心肌缺血再灌注損傷模型中HSP70的表達可以發揮顯著的心肌保護作用。HSP70是缺血預適應DP效應作用機制中重要的“效應子”，其主要通過抗氧化應激來發揮保護作用。HSP70能夠抑制促進氧自由基生成的關鍵酶的活性(即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶)，通過反饋抑制調節減少氧自由基的生成；HSP70的抗氧化生物活性可以促進機體內源性抗氧化劑的合成和釋放增加，HSP70與其結合物可以通過激活蛋白激酶C，增強蛋白酶活性，促進三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)水解，刺激生成超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，從而加快氧自由基的清除，研究發現SODmRNA水平的增高與HSP70mRNA表達的增高相一致［4］。在本實驗中，芪參益氣滴丸預適應的心肌細胞中HSP70蛋白含量與mRNA表達均顯著提高，與缺氧預適應結果一致，結合細胞損傷測定實驗的結果，可以說明芪參益氣滴丸預適應通過上調HSP70的表達對缺氧復氧損傷細胞達到延遲保護作用。

為進一步確定芪參益氣滴丸發揮保護作用的途徑，實驗中加入特異性抑制劑NAC以阻斷“效應子”環節HSP70的表達，結果一方面缺氧預適應的保護作用被取消，同時HSP70的表達被抑制，而另一方面缺氧預適應與芪參益氣預適應共同作用的心肌細胞在缺氧復氧損傷后依然保持活力，并且HSP70的表達顯著上調。這進一步說明芪參益氣滴丸預適應不但能夠激發心肌細胞內源性HSP70的釋放，而且可以推論其激發機制應是多途徑的。通過多途徑啟動機體內源性調節機制來發揮治療作用是中醫藥的作用特點，很多實驗研究證實中藥對心肌缺血再灌注損傷的保護作用是多因素、多途徑的調節過程［11］。正如張景岳云：“凡治病之道，攻邪在乎針藥，行藥在乎神氣。故施治于外，則神應于中，使之升則升，使之降則降，是其神之可使也。若以藥劑治其內而臟氣不應，針艾治其外而經氣不應，此其神氣已去，而無可使矣”［12］。

芪參益氣滴丸是以現代科技提取黃芪、丹參、三七、降香中的有效成分精制而成的滴丸制劑，是中醫傳統理論和現代制劑技術結合的結晶［13］。研究證明，黃芪總皂苷可以通過上調HSP70表達發揮對心肌細胞的抗氧化保護作用［14］；丹參酮ⅡA預處理對心肌細胞缺氧復氧損傷有顯著的延遲保護作用且與增加HSP70蛋白表達有關［15］；三七總皂苷長時間處理可促進HSP70的表達，對再灌注損傷心肌有良好的保護效應［16］；降香總萜和降香總黃酮在冠心丹參處方對抗心肌細胞缺氧復氧損傷的作用中不可缺如［17］。芪參益氣滴丸最大限度的發揮了藥物對心肌細胞的保護作用，在對缺氧復氧損傷心肌細胞的保護方面具有與缺氧預適應相當的作用，其作用機制與多途徑上調HSP70的表達有關。

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