熄風膠囊對難治性癲癇大鼠海馬Ⅰ型鈉通道 α 亞基蛋白及 m RNA表達的影響*

房艷艷 ，李新民，路巖莉 ，韓耀巍 ，聶 坤，吳 超

1天津中醫藥大學，天津 300193；2天津中醫藥大學第一附屬醫院

難治性癲癇是指頻繁的癲癇發作至少每月4次以上，應用適當的一線抗癲癇藥物(AEDs)正規治療，藥物穩態血濃度在有效治療范圍內，無嚴重的藥物副反應；至少觀察2年，發作仍不能控制，影響日常生活；無進行性中樞神經系統疾病或占位性病變［1］。電壓門控鈉通道基因突變與癲癇的發生密切相關，涉及到編碼電壓門控性鈉通道亞型Na1.1的基因SCNIA突變最為重要。基因突變可改變鈉離子通道電生理功能，如電流-電壓曲線的移動、電流幅度增加、失活減慢等，使得神經元的興奮性增加，造成神經元高頻高幅的異常放電波，進而導致遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥、Dravet綜合征、顳葉癲癇等多種癲癇病理類型。本實驗將以IE難治性癲癇耐藥機制形成為切入點，從電壓門控性鈉通道的基因表達入手，系統觀察熄風膠囊對IE的治療效果，闡明其治療IE的可能作用機制，為臨床應用和進一步研究提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠，平均體質量(45±10)g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供［許可證號：SCXK(軍)2012-0004］。

1.2 實驗藥品 氯化鋰(100 g/瓶，美國Sigma公司，批號：115K1308)、阿托品(5 mg/mL，天津金耀氨基酸有限公司，批號：H12020384)、鹽酸匹羅卡品(5 g/瓶，美國Sigma公司，批號：066k1730)、地西泮注射液(5 mg/mL，天津金耀氨基酸有限公司，批號：0804032)、熄風膠囊［院內制劑，藥物組成：紫河車12 g，石菖蒲12 g，天麻8 g，僵蠶4 g，郁金8 g，全蝎4 g，姜半夏8 g。0.33 g/粒，天津中醫藥大學第一附屬醫院杏林藥廠，津藥制字(2001)Z第0252號］、卡馬西平(200 mg/片，北京諾華制藥公司，批號：H11022279)。

1.3 試劑及儀器 SCN1A抗體，牛血清-干燥血清，寧波新芝分子雜交爐，LF-III顯微鏡奧林巴斯 BX43，Image-Pro Plus(IPP6.0)軟件等；組織蛋白抽提試劑盒(CWbio.Co.Ltd Cat.No CW08911。2)SCN1A antibody(Biorbyt#orb13681)，SW-CJ-1D型超凈臺(江蘇通凈)，QL-902型渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，離心機(Eppendorf，Centrifuge 5415D)，酶標儀(Thermo，MultiSkan3)，電泳槽(Cavoy，Mini P-4)、電泳儀(Bio-Rad)、半干轉槽(Bio-Rad)等；無RNA酶的EPpendorf管，液氮，-80℃冰箱，超純RNA提取試劑盒，HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒，UltraSYBR Mixture，DNase I均購自CWbio公司，熒光定量PCR儀(Bio-rad IQ5)。

1.4 方法

1.4.1 造模基本步驟 參照Honchar［2］和余倩［3］的方法：采用鋰-匹魯卡品注射方法，制備難治性癲癇大鼠模型。將150只大鼠隨機分成2組，正常對照組13只，其余137只用于模型的建立。氯化鋰按127 mg/kg劑量進行腹腔注射，18小時后硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射以減少外周膽堿能作用，30分鐘后匹羅卡品30 mg/kg(濃度1%，首次20 mg/kg，30分鐘后10 mg/kg)腹腔注射，大鼠出現癲癇持續狀態1小時后，再給予腹腔注射地西泮10mg/kg解除抽搐，如癇性發作不能緩解，可重復注射地西泮1～2次，直到癇性發作被解除。

1.4.2 模型評價驚厥評分采用Racine評分法 驚厥評分采用Racine評分法［4］：癇性發作達到Ⅳ級及以上，持續時間超過30分鐘，解除癇性發作后狀態良好的大鼠為合格的模型。本實驗造模前大鼠共150只，其中24只出現0-Ⅲ級發作，表現為無反應、耳面部抽搐、肌陣攣伴或不伴直立位等，為點燃不成功大鼠，予以剔除。造模后達到Ⅳ級及以上的大鼠共113只，在造模過程中由于癲癇頻繁發作死亡16只，在接下來的一周，大鼠的主要表現為精神萎靡、進食活動少、消瘦，暫不給予藥物及生理鹽水等灌胃處理，予葡萄糖鹽水及水果碎片飼養加強營養支持。期間6只大鼠相繼死去，對剩余存活且精神狀態良好的91只大鼠，每組13只分為7組，加空白組13只，共8組。

1.4.3 動物分組及灌胃計量 將造模成功的91只大鼠隨機分為7組，分別為模型對照組(模型組)、熄風膠囊低劑量組(熄低組)、熄風膠囊中劑量組(熄中組)、熄風膠囊高劑量組(熄高組)、卡馬西平治療組(CBZ組)、熄風膠囊中劑量+卡馬西平組(熄卡組)、熄風膠囊中劑量+1/2卡馬西平組(熄卡低組)，每組大鼠13只。造模前隨機選取13只大鼠，作為正常對照組(空白組)。其中熄低組：熄風膠囊0.33 g，濃縮劑2 mL；熄中組：熄風膠囊0.66 g，濃縮劑 2 mL；熄高組：熄風膠囊 0.99 g，濃縮劑 2 mL；CBZ 治療組：CBZ 20 mg/kg；熄卡組：熄風膠囊0.66 g，濃縮劑2 mL和CBZ 20 mg/kg；熄卡低組：熄風膠囊0.66 g，濃縮劑2 mL和CBZ 10mg/kg；空白組和模型組給予生理鹽水2 mL。每天上午灌胃1次，共持續60天。

1.4.4 標本制備及檢測方法

1.4.4.1 免疫組化 各組隨機選取2只大鼠，迅速斷頭取腦，置于冰盤上4%戊二醛固定液中剝離腦組織，將含有雙側海馬的腦組織放入4%多聚甲醛緩沖液中固定，并標記；免疫組化染色法染色：組織脫蠟、組織復水、組織抗原修復、去除組織內的內源性過氧化物酶、血清封閉組織切片、血清封閉組織切片、二抗孵育、DAB顯色、組織脫水、透明；采用Image-Pro Plus(IPP6.0)軟件對圖像進行分析，計算平均陽性光密度。

1.4.4.2 Western-blot 各組隨機選取4只大鼠，迅速斷頭取腦，冰盤上迅速剝離出雙側海馬及皮層置于無RNA酶的EPpendorf管中，標記后放入液氮罐之內暫存，隨后保存于-80℃冰箱中，備用于RNA的提取；Western-blot：抽提蛋白后BCA法蛋白定量，對蛋白濃度調整，然后進行目的蛋白、內參蛋白WB實驗；將光片采用 Bio-Rad2000型凝膠成像系統掃描后，應用QUANTITYONE軟件進行吸光度分析，測定灰度值，代表蛋白的表達量(Pgp/β-actin)。

1.4.4.3 Real-time RT-PCR 各組隨機選取4只大鼠，將大鼠迅速斷頭，剪開顱頂部皮膚，剝除顱骨，用高溫高壓消毒過的器械將鼠腦剜出，置于無菌冰盤，迅速剝離出雙側海馬及皮層置于無RNA酶的EP pendorf管中，標記后放入液氮罐之內暫

存。隨后保存于-80℃冰箱。采用超純RNA提取試劑盒提取總RNA：于樣品中加入1 mL上樣緩沖液，溶解后的RNA進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，待溴酚藍遷移至凝膠長度2/3時停止電泳，取出凝膠在紫外透射儀上觀察5、18和28 s條帶并攝影記錄。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，總反應體系20 μL。反轉錄條件是：37℃孵育40分鐘，反應結束后85℃保溫5分鐘。反轉錄產物-20℃保存備用。采用熒光定量PCR儀，用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

1.5 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行統計學處理。計量資料采用(±s)表示，多組比較采用one-way ANOVA分析，兩兩比較用q檢驗；設置雙側檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 免疫組化

2.1.1 空白組可見少量細胞表達SCN1A 神經元細胞陽性染色顯示胞體形狀多呈棱椎形。神經膠質細胞染色顯示胞體多為三角形、橢圓形或多邊不規則形。SCN1A免疫陽性顆粒主要分布在細胞的胞膜和胞漿。模型組主要表現為大量神經元細胞空泡樣變性、壞死，神經膠質細胞數量增加。治療組可以見到大量胞漿呈黃色、胞核較大的神經細胞和胞漿呈黃色的毛細血管內皮細胞，和部分胞漿呈黃色、胞核較小、致密的神經膠質細胞，呈陽性表達。見圖1。

圖1 Ⅰ型鈉通道α亞基蛋白的表達情況(X200)

2.1.2熄風膠囊對IE大鼠海馬SCN1A分布范圍的影響 對所得數據進行分析發現，與空白組比較，模型組SCN1A的表達水平上調(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組的SCN1A的表達水平均下調(P＜0.05)；與CBZ組相比，熄卡組SCN1A的表達水平低于CBZ組(P＜0.05)；中藥組各組之間均沒有顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 熄風膠囊對IE大鼠海馬SCN1A分布范圍的影響(±s)

表1 熄風膠囊對IE大鼠海馬SCN1A分布范圍的影響(±s)

注：與空白組比較，◆表示P＜0.05；與模型組比較，■表示P＜0.05；與CBZ組比較，▲表示P＜0.05

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2.2 Western-blot

2.2.1 BCA定量檢測結果 BCA定量檢測標準檢測結果及其標準曲線，見表2，圖2。

2.2.2 SCNIA目的條帶及內容條帶結果 樣品檢測上樣順序、蛋白濃度及條帶圖像，見圖3。

2.2.3 熄風膠囊對IE大鼠海馬SCN1A表達程度的影響 對所得數據進行分析發現，與空白組比較，模型組SCN1A的表達高于空白組(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組SCN1A的表達均低于模型組(P＜0.05)；與CBZ組比較，熄卡低組SCN1A的表達低于CBZ組(P＜0.05)；中藥組各組之間均沒有顯著差異(P＞0.05)。見表3。

表2 BCA定量檢測標準品檢測結果

圖2 BCA定量檢測標準曲線

圖3 SCN1A目的條帶及內參條帶結果

表3 熄風膠囊IE大鼠海馬SCN1A表達程度的影響(±s)

表3 熄風膠囊IE大鼠海馬SCN1A表達程度的影響(±s)

注：與空白組比較，◆表示P＜0.05；與模型組比較，■表示P＜0.05；與CBZ組比較，表示P＞0.05

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2.3 Real-time RT-PCR

2.3.1 各基因擴增的標準曲線 選取樣本cDNA進行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增，同時在60～95℃進行融解曲線分析。從圖4可見，標準曲線的R2均達到0.99，說明線性相光度很高，而且擴增效率均在90%以上，因此可以采用這種方法和上述引物對后續樣本進行擴增分析，見圖4。

圖4 SCN1A基因標準曲線圖及產物溶解曲線圖

2.3.2 熄風膠囊對IE大鼠海馬SCN1AmRNA表達水平的影響 對所得數據進行分析發現，空白組為模型組的0.85倍，說明模型組SCN1A mRNA的表達較空白組表達上調；CBZ組SCN1A mRNA的表達較模型組上調，為模型組的1.15倍；中藥組中熄高組、熄中組、熄低組SCN1A mRNA的表達較模型組下調，分別為模型組的0.86倍、0.82倍、0.93倍；聯合組中熄卡組SCN1A mRNA的表達較模型組下調，為模型組的0.88倍，熄卡低組SCN1A mRNA的表達較模型組上調，為模型組的1.16倍。本實驗結果提示熄高組、熄中組、熄低組、熄卡組對SCN1A mRNA表達有抑制作用，而卡馬組、熄卡低組對SCN1AmRNA表達有促進作用。見表4。

3 討論

電壓門控性鈉通道是細胞動作電位產生的結構基礎，鈉電流可引起細胞的去極化和傳導興奮，與神經元持續反復性放電的發生有關。海馬的功能通過各種離子通道完成，其中鈉離子通道開放引起的去極化內向電流是興奮性細胞產生動作電位的關鍵［5-6］。電壓依賴性鈉通道在神經元興奮中起的重要作用，決定神經元放電的持續時間和頻率，其活性的改變是許多神經元興奮性異常相關疾病(癲癇、缺血性腦損傷等)的病理基礎［7-8］。

VGSCsI型α亞基基因(SCN1A)在中樞神經系統中主要表達于胞體和樹突上，也表達于某些中間神經元的軸突起始段［9］。位于2號染色體長臂2區4帶，大小為81 kb，由26個外顯子編碼。在所有編碼NaV的基因中，編碼Na1.1的基因SCNIA與癲癇有關的基因突變的數量是最多的，同時SCN1A也被認為是與癲癇的關系最為密切的一個。研究發現SCN1A的突變與癲癇的幾個表現型也是有因果關系的，例如遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥(GEFS+)、Dravet綜

合征(DS)和顳葉癲癇(TLE)［10］。

Yu等［11］通過定向敲除小鼠SCN1A基因構建了SMEI小鼠模型。結果顯示在純和Scn1a-/-小鼠海馬錐體細胞記錄到正常水平鈉電流，這可能與Nav1.1在此種神經元中分布較少有關。與此相反，海馬GABA能抑制性中間神經元(如雙極細胞)鈉電流顯著減少。此外，小腦GABA能浦肯野細胞也表現出峰電流、持續和復活鈉電流都顯著減少，這是小鼠表現出嚴重共濟失調的原因［12］。有學者通過將R1648H突變導入同源小鼠基因中構建了GEFS+基因敲入小鼠模型。實驗發現R1648H基因突變小鼠純合突變體(Scn1aRH/RH)具有自發的全面性發作，然而雜合突變體(Scn1aRH/+)自發性全面性發作、高溫誘導癲癇和三氟乙醚誘導癲癇發作閾值降低。在興奮性錐體細胞中僅表現出輕度加速那通道復活的作用，而在雙極神經元中，鈉電流的幅值卻明顯降低。以上研究結果表明，Nav1.1在GABA能神經元的表達高于興奮性神經元(如錐體細胞)的表達。SCN1A基因突變選擇性影響高表達Nav1.1的GABA能神經元，使其鈉電流密度減小、爆發高頻動作電位的能力下降。而抑制性GABA能中間神經元興奮性降低，會導致GABA能神經元抑制作用減弱，從而引起大腦內興奮和抑制作用失衡，引發癲癇。

馬融教授根據IE反復發作、病程纏綿、遷延不愈的特點，根據腎-精-髓-腦的密切關系，及“久病必虛”“久病必瘀”“久病入絡”的中醫理論，提出IE病機關鍵在于腎精虧虛，痰瘀阻絡，應治以益腎填精、豁痰熄風、化瘀通絡，并在此基礎上研制出中藥復方熄風膠囊，標本兼顧，扶正祛邪以進行治療。在臨床研究上，馬融等［13］通過觀察提出熄風膠囊是一種治療小兒癲癇強直-陣攣性發作的有效中藥。路巖莉等［14］通過觀察癲癇患兒右熄風膠囊治療后腦電圖癇樣放電頻率在清醒、慢波睡眠和快波睡眠階段較治療前明顯減少。表明熄風膠囊在臨床上治療癲癇是有效的。

本實驗通過免疫組化、Western-blot、Real-Time PCR法檢測到IE大鼠海馬SCN1A在蛋白與mRNA兩個層面均表達上調。通過與正常大鼠比較，大鼠海馬SCN1A蛋白表達顯著增高；另外，IE大鼠海馬各個部位，均可見SCN1A蛋白表達陽性細胞，包括CAI、CA3和齒狀回區。研究已經證實海馬的錐體神經元可以產生異常電活動和動作電位的簇發，進而可以導致癲癇樣活動的產生。第二，中藥復方熄風膠囊單藥及聯合卡馬西平用藥干預后IE大鼠海馬SCN1A在蛋白與mRNA兩個層面均表達下調。提示中藥復方熄風膠囊可能通過抑制IE大鼠鈉通道的基因表達而發揮治療作用。

參考文獻

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