黃連總生物堿的提取純化及含量測定

張中華，趙亞蘭

甘肅省中醫院藥學部，甘肅 蘭州 730050

黃連為毛茛科植物黃連(Coptis.chinensis Franch.)、三角葉黃連(Copfis.deltoidea C.Y.Chenget Hsiao)或云連(Coptis.teeta wall)的干燥根莖，作為中藥始載于東漢《神農本草經》，被列為上品［1］。其性寒味苦，可清熱燥濕，瀉火解毒?！睹t別錄》記載黃連可“止消渴”；《本草綱目》也有“治消渴，用酒蒸黃連”的記載。而黃連苦寒能瀉上、中、下三焦之火，火去則津液無煎，消渴自止。黃連苦寒，善清心火，火去則不吸爍真陰，腎水得復，況黃連苦寒亦可厚腸胃以堅陰，故消渴者，黃連何畏［2］。黃連為我國傳統中草藥，有著長期的藥用歷史以及豐富的民間用藥經驗，它含小檗堿、黃連堿、甲基黃連堿、巴馬亭，藥根堿等多種生物堿，并含黃酮(已發現的苷元有槲皮素與金合歡素)、黃柏內酯等［3］。有學者研究表明，從黃連中提取的小檗堿、黃連堿、巴馬亭以及黃連的醇提取物均能有效地促進5-氟尿嘧啶的透皮吸收，增加極性藥物在皮膚中的濃度，與表面活性劑一樣具有增加皮膚滲透性的作用［4］。天然透皮吸收促進劑以起效快、效果好、副作用小等優點，正日益引起人們的重視。因此，從天然產物中尋找透皮吸收促進劑，具有廣闊的應用前景［5］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-1800PC型紫外分光光度計；BT 125D分析天平(感量0.01 mg)；JY4001型電子秤(上海精科天平儀器廠)；PTHW型調溫電熱套(2000ML，420 W鞏義市予華儀器有限責任公司)；通一牌DW 1 000 ML型套式調溫電熱套(500 W江蘇通州市電熱器廠)；循環水多用真空泵(SHB-3型鄭州杜甫儀器廠)；恒溫水浴鍋(金壇市大地自動儀器廠)；HC-TP11-5架盤藥物天平(感量0.5 g上海第二天平儀器廠)；SB-5200 DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；CS101型電熱鼓風干燥箱(中國重慶試驗設備廠)。

1.2 試藥 黃連飲片(購自蘭州復興厚藥材有限責任公司)，甘肅中醫藥大學藥學系中藥藥劑教研室魏舒暢副教授鑒定為藥典收載品種；鹽酸小檗堿(對照品，購自中國藥品生物制品鑒定所，批號：110713-200609，鹽酸小檗堿含量98.1%)。硫酸、鹽酸、氫氧化鈣、氨水、95%乙醇，均為分析純。

2 方法與結果［2-6］

2.1 黃連提取物的制備

2.1.1 黃連總生物堿的提取 取500 g黃連粗粉，加22倍量70%乙醇回流提取3次，每次1小時，提取液回收乙醇，將稠膏在水浴鍋上濃縮至干燥；同法再提取黃連粗粉1 000 g。得干膏419.2 g，出膏率為27.9%。將干膏(提取物Ⅰ)置干燥器內，待進一步分離純化小檗堿用。

2.1.2 黃連總生物堿的純化 取100.4 g干膏置1 000 mL燒杯內，加10倍量0.5%H2SO4溶解，靜置，過濾，得酸水液；在酸水液中加石灰乳調PH至9，過濾，得濾液A；在濾液A中加濃鹽酸調PH至1，加入藥液量8%的氯化鈉鹽析，放置，過濾，得沉淀A與濾液B；將在沉淀A溶于1 000 mL熱水，調PH至9，趁熱過濾，在濾液中，并將沉淀水洗至中性，得母液(提取物Ⅱ)與鹽酸小檗堿粗品；在濾液B中加氨水調PH至9，放置，過濾，得沉淀，并將沉淀用乙醇重結晶，得小檗胺(提取物Ⅲ)。同法再處理200 g干膏。最后將得到的鹽酸小檗堿粗品再溶于熱水，加鹽酸調PH至3，放置，過濾，得較純鹽酸小檗堿(提取物Ⅳ)。

2.2 黃連總生物堿的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品1.18mg，置于10mL容量瓶中，用0.05mol H2SO4溶解并定容至刻度，搖勻；從上述溶液中精密移取2.5 mL至10 mL容量瓶中，用0.05 mol H2SO4定容至刻度，搖勻，得對照品貯備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取鹽酸小檗堿供試品7.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用0.05 mol H2SO4溶解并定容至刻度，搖勻；從上述溶液中精密移取1.0 mL至10 mL容量瓶中，用0.05 mol H2SO4定容至刻度，搖勻。

2.2.3 測定波長的確定 取對照品儲備液與供試品溶液，以0.05 mol H2SO4為空白，波長自200～800 nm，掃描間隔為1 nm，對對照品與供試品進行最大波長掃描，在最大吸收峰處確定測定波長為264 nm，掃描圖譜見圖1。

圖1 鹽酸小檗堿對照品和供試品最大波長掃描圖譜

2.2.4 供試品的含量測定 精密稱取鹽酸小檗堿標準供試品7.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用0.05 mol H2SO4溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取供試品液1.0mL至10 mL容量瓶中，用0.05 molH2SO4定容至刻度，搖勻，以0.05molH2SO4硫酸為空白對照，在264nm波長處測定吸光度。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取對照品儲備液0.2、0、0.8、1.2、1、2、3.0 mL 分別至 10 mL 容量瓶中，用0.05 mol H2SO4定容至刻度，搖勻，以0.05 mol H2SO4為空白對照，在264 nm處測定吸光度，其吸光度值見表1。

表1 對照品濃度與對應的吸光度值

以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，見下圖。

線性方程為 A=79.617C-0.022，r=0.999 9，鹽酸小檗堿在0.579～8.682 μg/mL范圍內，濃度與吸光度呈現良好的線性關系。

2.3.2 穩定性實驗 取同一批次的供試品溶液，分別于 0﹑1、2﹑3﹑5、8 小時進樣測定，測定結果的穩定性好，結果見表2。

表2 不同時間測定樣品中總生物堿的吸光度值

2.3.3 精密度實驗 取供試品溶液，在264 nm處重復測定其吸光度，結果表明儀器精密度良好。見表3。

表3 精密度試驗結果

2.3.4 重復性試驗 取同批供試品5份，每份取樣量依次為 13.0、9.0、8.0、7.0、7.0 mg，分別按供試品溶液制備方法操作測定，計算鹽酸小檗堿含量，結果表明試驗重復性良好。見表4。

2.3.5 加樣回收試驗 取已知含量(71.4%)的供試品7.0 mg，按供試品溶液制備項下方法操作，制備供品溶液，精密吸取5 mL，置10 mL量瓶中，精密加入鹽酸小檗堿對照品儲備液(0.0236mg/mL)1 mL用0.05 M硫酸定容至刻度，搖勻，分別測定其吸光度，結果表明回收率及RSD值可確定加樣回收率符合規定。見表5。

2.4 供試品含量測定 取不同批號的供試品，按測定法項下的方法操作并測定。供試品的測定結果表明黃連中提取的總生物堿中鹽酸小檗堿的含量為92.84%，可供透皮實驗用。見表6。

表4 重復性室驗結果

表5 回收率測定結果

表6 供試品中鹽酸小檗堿的含量測定結果

3 結論

供試品中總生物堿的純度較高，鹽酸小檗堿的含量可達92.84%。采用紫外可見分光光度法測定黃連中總生物堿的含量，在測定波長過程中可能還有其他物質的吸收，會導致測定結果偏高［6］。

生物堿與黃酮等物質在70%的乙醇中溶解度都較好，因此藥材粗粉用70%的乙醇提?。恍￠迚A的硫酸鹽在水中溶解度較大(1∶30)，其鹽酸鹽在水中溶解度較小(1∶500)，因此將干膏用0.5%H2SO4溶解使生物堿成硫酸鹽溶于水中。

酸水液中加石灰乳調至pH 10～12，一是吸附雜質，二是調堿性；堿液中加鹽酸調至pH 1～2使生物堿的硫酸鹽轉變成鹽酸鹽，再加入藥液量6%～10%氯化鈉使鹽酸鹽反應完全［7］；析出的鹽酸鹽溶于熱水，加石灰乳調至pH 8.5～9，是進一步除雜，在此堿液中加鹽酸調至pH 2～3使生物堿以鹽酸鹽的形式再次結晶析出，對其進行純化。

參考文獻

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.一部.北京：中國醫藥科技出版社，2015：303-305．

［2］林漢欽，蔡培俊.淺談黃連在糖尿病治療中的作用［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2010，8(22)：45-46．

［3］匡海學，黃小萍，石任兵，等.中藥化學［M］.北京：中國中醫藥出版社，2008:350-352.

［4］張仲源，張惠生，張麗敏.透皮促進吸收的中藥材(三)［J］.中國外治雜志，2010，19(4):63-64.

［5］張慧，肖莉，許建辰，等.天然透皮吸收促進劑的研究進展［J］.中國藥房，2005，16(4):303-304.

［6］龔濤，孫冰.黃連提取工藝的研究［J］.中草藥，2008，29(7):446-448.