HPLC法測定不同基質(zhì)樣品中羅丹明B含量

(山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西 太原 030001)

羅丹明B(Rhodamine B)又稱玫瑰紅B、蕊香紅B、若丹明B、或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的染料，屬于非食品原料。我國于2008年明確規(guī)定不允許將羅丹明B用作食品添加劑及食品染色。本文提出采取固相萃取柱對樣品進(jìn)行萃取濃縮凈化處理，用高效液相色譜法-熒光檢測器測定不同食品基質(zhì)中衡量羅丹明B的方法。

1 儀器和試劑

甲醇、丙酮、正己烷均為色譜級；實(shí)驗(yàn)用水符合一級水標(biāo)準(zhǔn)；羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer GmbH 95%)；Alumina-N固相萃取小柱(500 mg/6 mL)；高效液相色譜儀(島津20A帶熒光檢測器)；BP211D電子天平，DV215電子天平。

2 方法

2.1 樣品的提取

精確稱取1 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL丙酮∶正己烷(20∶80)混合溶液，300 rpm振蕩10 min，4 000 rpm離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于50 mL雞型瓶中，殘渣重復(fù)提取一次，合并上清液，于40℃旋蒸至10 mL左右，待凈化。

2.2 凈化[1,2]

將上述提取液加入Alumina-N固相萃取小柱(用前加5 mL丙酮∶正己烷(20∶80)混合溶液預(yù)處理)中，等溶液全部通過，加入丙酮∶正己烷(20∶80)混合溶液20 mL淋洗，最后加10 mL 90%甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液于10 mL比色管中，用90%甲醇水溶液定容，過0.22μm濾膜，待分析。整個凈化過程控制流速在3～5 mL·min-1。

2.3 色譜條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠 (250 mm×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇∶水(65∶35)；流速：1.0 mL/min；激發(fā)波長：550 nm；發(fā)射波長：580 nm。在此條件下考察，空白樣品基質(zhì)對測定無干擾。(見圖1、2)。

圖1 羅丹明B對照溶液圖

圖2 空白樣品圖

3 結(jié)果與討論

3.1 洗脫液體積的選擇

取1.0μg·mL-1羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液25μL，加入10 mL丙酮∶正己烷(20∶80)溶液混勻，過Welchrom Alumina-N柱，分別加5、10、15、25 mL，90%甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液，定容至5、10、15、25 mL，進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果分別為23.341 ng、24.727 ng、24.989 ng和24.939 ng，回收率分別為90.33%、95.69%、96.71%和96.51%，表明淋洗液體積大于10 mL時，樣品的回收率趨于恒定(見圖3)。

圖3 不同體積淋洗液回收率

3.2 柱效評價

取0.099、0.99μg·mL-1羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)溶液各25μL，加入10 mL丙酮∶正己烷(20∶80)溶液混勻，過Welchrom Alumina-N柱，進(jìn)樣，記錄峰面積回收率分別為89.73%和94.64%。

3.3 固相萃取小柱耐用性

選擇市場上不同品牌的中性氧化鋁固相萃取小柱，進(jìn)行耐用性評價，耐用性良好。見表1。

表1 耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取適量羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用90%甲醇溶液稀釋成0、 0.5，1.0、1.5、2.0、5.0、10.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取10μL，注入液相色譜測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，在0.5～10.0 ng·mL-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

3.5 方法檢測限

經(jīng)線性擬合后推算預(yù)期最低檢出限(MDL)為0.093 ng/g。按此濃度的5，10，25倍做加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。當(dāng)加標(biāo)量為2.5ng·g-1(25倍)時，回收率為84%～110%，滿足實(shí)驗(yàn)需求，故該方法的方法檢出限為2.5ng·g-1。

3.6 回收率及重復(fù)性

用標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度, 用平行實(shí)驗(yàn)的精密度驗(yàn)證方法的重復(fù)性。加標(biāo)溶度為2.5μg·kg-1，5.0μg·kg-1，12.5μg·kg-1三水平。用方法(2.1)來處理樣品,在樣品混勻中添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)放置，按照方法(2.2)進(jìn)行凈化,在(2.3)的色譜條件下進(jìn)樣，測的濃度及計算的回收率。見表2。

表2 不同基質(zhì)回收率結(jié)果

4 結(jié)論

采用該方法羅丹明B檢測低限為2.5μg·kg-1。不同基質(zhì)樣品添加三水平實(shí)驗(yàn)，回收率結(jié)果均良好。實(shí)驗(yàn)操作簡單，試劑消耗少，時間周期短，可以滿足不同食品中非食用物質(zhì)羅丹明B快速準(zhǔn)確檢測定性定量的要求。

[參考文獻(xiàn)]

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