結腸癌差異DNA甲基化位點初篩及糞便樣本細胞中RUNX3基因的異常甲基化譜構建

吳鵬，吳平平，馬常蘭，施風

(1.江蘇建康職業學院 臨床與護理學院，江蘇 南京 210029； 2.江蘇省腫瘤醫院 腫瘤內科，江蘇 南京 210009)

我國結腸癌的發病率呈逐年上升的趨勢，是威脅國人健康的重大疾病[1- 2]。腸鏡侵入檢查是目前最主要的檢查方法之一，但臨床上常會碰到許多問題，比如取材時組織損傷或組織量少難以做出正確的預后判斷；電子計算機體層攝影(CT)等影像學檢查因經濟或造影劑毒性而限制了使用；外周血活檢也存在患者理解不足、畏于抽血而致依從性差等[3]。糞便中含有來自腸道腫瘤的脫落細胞，具有一定的特異性，是結直腸癌預后評估理想的無創檢測素材，且患者接受程度高，依從性好，其將推動結直腸癌預后研究的重大變革，具有重要的科研和應用價值[4]。

表觀遺傳機制在基因表達調控上提供了一種高層次的調控模式，被認為是控制基因活動的“開關”，已成為后基因組時代研究的熱點[5- 6]。脫氧核糖核酸(DNA)甲基化是目前發現的最主要的一種表觀遺傳修飾形式，其在結腸癌等多種腫瘤的研究中有了長足的進展[7]。我們前期在85例結直腸癌及45例腸道良性病變患者血清標本中，通過甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP)檢測基因啟動子區域甲基化，發現DLC1、p16和RUNX3基因甲基化比例分別為42.4%、44.7%和34.1%，均顯著高于良性病變組(P<0.01)，三者聯合檢測可顯著提高結直腸癌檢出率，并且特異性未降低[8]。甲基化的DNA片段可以在糞便中檢測到，這種非侵襲性的檢查方法使甲基化檢測有了更好的應用前景，可成為結腸癌預后評估新突破口[9- 10]。

作者將系統性研究糞便樣本細胞中異常甲基化譜，尤其是RUNX3基因的甲基化研究，有望獲得一組能應用于臨床的新型分子標記，為結腸癌的診斷、治療及預后提供有力的支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇結腸癌患者的癌組織和癌旁組織的存檔蠟塊，用于差異DNA甲基化位點初篩。收集江蘇省腫瘤醫院2015年1月至2015年12月間100例結腸癌患者新鮮糞便，100例健康體檢者為健康對照組。所有病例均有完整的臨床及隨訪資料，用于異常甲基化譜的構建。

1.2 樣本處理

對于癌組織和癌旁組織的存檔蠟塊用激光捕獲顯微切割技術收集細胞[11]，經研磨、勻漿后提取基因組DNA。對于新鮮糞便樣本，使用Qiagen QIAmp? DNA Stool Mini Kit按照產品操作規程來分離提取DNA。樣本的分組情況見表1。

表1樣本的分組情況

樣本分組實驗編號樣本例數(男∶女)/例結腸癌組織T63∶3結腸癌旁組織N63∶3結腸癌患者新鮮糞便S?T10059∶41正常人新鮮糞便S?N10055∶45

1.3 差異DNA甲基化位點初篩

針對RUNX3基因，經亞硫酸氫鹽修飾、擴增、斷裂、沉淀、重懸等操作，在Illumina Infinium Methylation EPIC BeadChip(850 k)甲基化芯片上進行雜交、洗滌、延伸、染色、掃描等過程獲得全基因組甲基化譜，通過生物信息學初步篩選差異性甲基化位點。

1.4 MSP方法

RUNX3啟動子區的甲基化引物(M)和未甲基化引物(U)序列如表2所示，以亞硫酸氫鹽修飾后的基因組DNA為模板，進行聚合酶鏈反應(PCR反應)。反應產物經含有EB的2%瓊脂糖凝膠電泳、紫外觀察、凝膠成像系統掃描成像后拍照，檢測擴增效果。

1.5 統計學處理

在原始數據扣除背景后進行標準化處理，然后計算甲基化程度水平(Beta值)，同時使用Beta混合物分位數擴張(BMIQ)的方法進行Beta值的標準化處理[12]，作為衡量甲基化程度的指標，同時采用層次聚類算法對差異甲基化位點進行聚類分析。進一步進行甲基化位置變化(methylation variable position)分析，即針對差異化甲基化位點最近鄰基因進行基因本體(gene ontology,GO)功能富集分析和京都基因與基因組(KEGG)功能富集分析。對于MSP結果，使用SPSS統計軟件進行分析，計量資料采用t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

表2RUNX3啟動子區MSP引物序列及反應條件

引物名稱引物序列溫度/℃大小/bpM58115 F5′?ATAATAGCGGTCGTTAGGGCGTCG?3′ R5′?GCTTCTACTTTCCCGTTCTCGCG?3′U57115 F5′?ATAATAGTGGTTGTTAGGGTGTTG?3′ R5′?ACTTCTACTTTCCCACTTCTCACA?3′

2 結 果

2.1 差異DNA甲基化位點分析

2.1.1 甲基化差異分析 使用Beta值的樣本密度箱形圖來評估甲基化芯片數據的整體分布。在箱形圖(圖1)中，癌組織(T)和癌旁組織(N)兩組之間最大值、最小值及中位數顯示兩者之間正態分布差異不明顯，適合聚類芯片分析。

圖1標準化處理后Beta值的箱式圖

熱圖結果顯示T和N兩組之間甲基化位點差異性排布，顏色越深代表甲基化位點差異越明顯，顏色越淺代表甲基化位點差異越不明顯，因此T組中存在較多高甲基化位點，而N組中存在較多低甲基化位點(圖2)。進一步通過主成分分析(PCA)發現T和N兩組之間呈現組內顯著富集，表明檢測結果無交叉影響，結果客觀可靠(圖3)。

圖2差異甲基化位點的熱圖

圖3差異甲基化位點的PCA分析

甲基化位點的差異性可以使用火山圖(圖4)來表示，其中紅點富集區域為T和N兩組之間甲基化位點呈顯著性差異(P<0.01)，偏右區域為與N組相比甲基化位點水平升高，偏左區域為與N組相比甲基化位點水平降低；黑點富集區域為T和N兩組之間甲基化位點呈不顯著性差異(P>0.01)。

2.1.2 差異甲基化位點功能分析 GO功能富集分析結果表明，共有145個差異甲基化基因的功能類別(FDR<0.05)，涵蓋了3 155個基因，其中生物過程、細胞組成和分子功能分別含有的基因功能類別為102、22和21個。KEGG功能富集分析結果表明共有28個差異甲基化基因的功能類別(P<0.05)，涵蓋了697個基因。經過上述分析，共篩選出RUNX3等10個差異顯著的DNA甲基化基因位點。

圖4T和N兩組甲基化位點差異程度的火山圖紅色虛線表示P=0.01

2.2 MSP檢測RUNX3啟動子甲基化狀態

根據甲基化芯片結果選取RUNX3啟動子甲基化位點，應用MSP做進一步組織樣本驗證及新鮮糞便樣本的檢測。使用MF、MR和UF、UR兩對引物擴增經亞硫酸鹽修飾后的DNA，若只有甲基化的引物能擴展出條帶則是完全甲基化的；若只有未甲基化的引物能擴增出條帶則是完全未甲基化；若兩對引物均能擴增出條帶則稱為半甲基化，也判斷為甲基化。

T和N兩組的擴增條帶如圖5和表3所示，檢測T樣本6例，其中5例為甲基化，1例為非甲基化，甲基化率為83.3%；N中1例為甲基化，5例為非甲基化，甲基化率為16.7%，經卡方檢驗兩者差異具有統計學意義(P<0.05)。新鮮糞便樣本的擴增條帶如圖6和表3所示，對于結腸癌患者(S- T)RUNX3啟動子的甲基化率為45.5%，而正常人(S- N)的甲基化率只有18.2%，經卡方檢驗兩者差異具有統計學意義(P<0.001)。

圖5兩對引物在T(A)和N(B)兩組中擴展出條帶的電泳圖

表3結腸癌和正常樣本的甲基化率

樣本分組RUNX3(+)(-)甲基化率/%χ2值P值T組5183．35．330．02N組1516．7S?T組445644．015．80<0．001S?N組188218．0

圖6兩對引物在結腸癌患者(A)和正常人(B)糞便樣本中擴展出條帶的電泳圖

3 討 論

本研究發現T組中存在較多高甲基化位點，而N組中存在較多低甲基化位點。GO功能富集分析結果表明共有145個差異甲基化基因的功能類別(FDR<0.05)，涵蓋了3 155個基因。生物過程部分包含的基因功能類別最多。本次研究表明，差異甲基化的功能基因主要集中在細胞膜、受體活性以及信號轉導等方面，與腫瘤的發生、發展與轉移等過程密切相關。與此同時，KEGG功能富集分析結果表明這些基因主要參與消化液分泌、神經突觸信號轉導、阿米巴樣運動等與結腸癌高度相關的分子事件。

經過差異甲基化芯片分析，共篩選出RUNX3等10個差異顯著的DNA甲基化基因位點。RUNX3基因位于人類染色體1q36.1，廣泛表達于消化道上皮細胞等多種細胞中。RUNX3基因是研究比較多的抑癌基因，其編碼的RUNX3蛋白是TGF- β介導的抑癌途徑的重要組分，與腫瘤的發生等過程密切相關[13]。RUNX3基因的甲基化則會抑制RUNX3基因的表達，進而影響TGF- β信號轉導通路，促進腫瘤的發生與發展。MSP結果表明，T RUNX3基因的甲基化水平明顯高于N，差異具有統計學意義(P<0.05)，進而驗證了差異DNA甲基化位點分析的結果，說明RUNX3基因甲基化檢測對結腸癌患者具有重要的意義。新鮮糞便樣本結果中結腸癌患者RUNX3啟動子的甲基化率明顯大于正常人，且差異具有統計學意義，進一步證明了實驗的結論。

本研究篩選出RUNX3等10個差異顯著的DNA甲基化基因位點，進一步分析了T/N、S- T/S- N新鮮糞便樣本細胞中RUNX3甲基化水平，結果提示RUNX3啟動子的甲基化可以用于結腸癌的診斷以及療效評價等方面。

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