金花普洱茶微生物組成譜的ITS和16sRNA基因文庫研究

寧偉澤，徐軍

北京市中關村中學，100000

云南的金花普洱作為普洱茶中的珍貴種類，在我國已有千年歷史[1]。金花普洱是普洱茶中的極品，用傳統工藝制成的普洱茶，除偶爾出現“金花”外，還無法做到人為控制“金花菌”在普洱茶中的增殖。近來以改良工藝制備的“金花普洱緊壓茶”是用云南大葉種茶為原料，經二次發酵制作而成，不僅茶多酚含量高，而且外觀有大量金色炫目的“金花”點綴，非常獨特[2]。“金花”民間稱“金花菌”，學名叫“冠突散囊菌”，是對人體有益的酵素類菌，能分泌多種胞外酶催化茶葉化合物的轉化，改善茶葉品質，并被認為具有強身健體、消食降脂、降糖抗氧化和防癌抗癌作用，而受到茶葉愛好者和研究者的關注[3]。

近來出現的“金花普洱緊壓茶”中點綴的“金花”就是“冠突散囊菌”嗎？它的大量增殖會對普洱茶發酵的微生物菌群有何影響？

傳統的微生物菌株鑒定和群落結構分析方法主要依靠選擇性培養基計數和形態學及生理生化檢測，這些研究方法存在分析不完整和鑒定不準確的問題[4]。隨著第二代高通量測序手段的成熟，宏基因組分析可以提供豐富數據，從ITS和16sRNA擴增子序列的聚類讀取，到全基因組所有結構域分析，允許樣本無須培養，直接進行測序分類[5-6]。ITS和16sRNA分別為真菌和細菌核糖體基因中的一部分，它具有種內基因序列相對一致而種間差異較為明顯的特征，通過二代測序技術檢測，可以特異準確系統全面地分析普洱金花菌緊壓茶中是否存在冠突散囊菌，以及其真菌和細菌的組成譜。研究結果不僅有助于推廣這一新的制茶工藝，而且將有益于全社會的健康事業。

一、材料與方法

1.樣品制備及建庫測序

金花普洱茶購于北京五方圣賢文化發展有限公司，5 g茶葉樣品用生理鹽水過濾，使用真菌DNA提取試劑盒提取對應的DNA。使用PCR擴增和TruSeq試劑盒構建文庫，HiSeq2500進行上機測序。

2.數據分析流程

（1）根據Barcode序列從下機數據中拆分出各樣品數據。截去Barcode和引物序列后，使用FLASH對每個樣品的序列進行拼接。參照Qiime，過濾處理得到高質量的序列。對比數據庫Unite da-tabase，檢測并去除嵌合體序列。

（2）OTU聚類和物種注釋：利用Uparse軟件對序列進行聚類，默認以97%相似度將序列聚類成為OTUs（Operational taxonomic units）。比對Unit數據庫，對OTUs代表序列進行物種注釋，并分別在各個分類水平：phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）統計各樣本的群落組成。

（3）香農熵（Shannon entropy）可以評價物種多樣性程度，因此用于比較真菌和細菌在茶葉中豐度的多樣性。

3.統計分析

ITS和16s測序中香農熵數值比較應用雙側T檢驗，統計軟件為SPSS 17.0.

二、結果與分析

1.ITS測序闡述真菌菌群分布

將金花普洱茶分成3份，每1份茶葉分別提取DNA，進行真菌的ITS二代測序。測序結果如表1所示，金花普洱茶中存在的真菌絕大多數屬于子囊菌門 （Ascomycota），散囊菌綱 （Eurotiomycetes），散囊菌目（Eurotiales），發菌科（Trichocomaceae），曲霉屬（Aspergillus）。在種水平，其中最高頻的OTU1（約99%）分別和4種真菌ITS區完全匹配，這4種真菌分別為：冠突曲霉（Asper?gilluscristatus，EF652078），肋狀曲霉 （Aspergillus?costiformis， HE615136）,謝瓦氏曲霉（Aspergillus?chevalieri，EF652068），謝瓦氏曲霉間型變種（As?pergillus intermedius，EF652074）。

2.16sRNA測序闡述細菌菌群分布

將金花普洱茶分成3份，每1份茶葉分別提取DNA，進行細菌的16sRNA二代測序。測序結果如圖1所示，變型菌門（Proteobacteria）和后壁菌門（Firmicutes）占到了所鑒定菌群的三分之二，是最具有優勢的菌門。γ-變型菌綱（Gammaproteobacteria）和桿菌綱（Bacilli）在所鑒定的菌群中占比也超過三分之二，是最具優勢的菌綱。但是在細菌目水平，不同樣本間菌群構成比差異較大，假單胞菌目（Pseudomonadales）和乳桿菌目（Lactobacillales）是最高頻菌目，但是其在不同樣本間的比例差異較大，其他菌目比例較低且在不同樣本間存在較大差異。在細菌科水平，3個樣本最具優勢的菌科分別為假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）和腸桿菌科（Enterobacteriaceae），而且其所占比例在不同樣本間差異較大。假單胞菌屬（Pseudomo?nas）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、志賀氏菌屬（Shi?gella）和鹽單胞菌屬(Halomonas)是最具優勢的菌屬，但在不同樣本中差異較大。

3.細菌和真菌多樣性比較

通過分析3份金花普洱茶的16sRNA和ITS測序結果發現，在屬水平，細菌和真菌特異屬的中位數分別為94和47。為了從整體上評價金花普洱茶的細菌和真菌分布情況，分別計算了金花普洱茶細菌和真菌的香農熵，其中細菌多樣性顯著高于真菌多樣性（P=0.001，雙側T檢驗）（圖2）。

表1 金花普洱茶真菌分布豐度

圖1 3份金花普洱茶樣品最高頻的10種細菌

圖2 3份金花普洱茶中細菌和真菌平均香農熵數值比較

三、討論

本研究首次采用高通量二代測序的方法評價金花普洱茶真菌和細菌組成譜。ITS測序結果顯示金花普洱茶富含曲霉屬真菌，其他屬真菌含量極低。但曲霉屬中，最高頻的菌種可能為冠突曲霉（As?pergilluscristatus，EF652078）、肋狀曲霉 （Aspergil?luscostiformis， HE615136）、謝瓦氏曲霉 （Aspergil?luschevalieri，EF652068）、謝瓦氏曲霉間型變種（As?pergillus intermedius，EF652074）中的一種或幾種。16sRNA測序結果顯示金花普洱茶中假單胞菌屬（Pseudomonas）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、大腸桿菌屬（Escherichia-Shigella）和鹽單胞菌屬（Halomo?nas)是最具優勢的菌屬，但是這幾種細菌在不同樣本中的比例差異較大，而且金花普洱茶中細菌種類及多樣性均顯著高于真菌的種類和多樣性。

“金花菌”的鑒定一直存在分歧，其中冠突散囊菌在2012年青霉和曲霉國際委員會（ICPA）大會上正式被命名為冠突曲霉[7]。傳統的微生物菌株鑒定和群落結構分析方法主要依靠選擇性培養基計數和形態學及生理生化檢測，這些研究方法存在分析不完整和鑒定不準確的問題[4]。本研究采用高通量二代測序技術檢測真菌ITS基因序列，可以客觀系統地分析金花普洱茶中真菌組成譜。本研究結果顯示，該種方法制作出的金花普洱茶富含曲霉屬真菌，但僅靠ITS測序無法最終確定最高頻的真菌為冠突曲霉，后續還需聯合β‐微管蛋白基因（BenA）、鈣調蛋白基因（CaM）及RNA聚合酶II基因（RPB2）序列對上述4種真菌進行全面鑒定。但是由于金花普洱茶中絕大多數為曲霉屬真菌，除冠突散囊菌外，其他和冠突散囊菌ITS區測序序列一致的3種真菌不會顯著抑制其他真菌的生長，因此金花普洱茶中最高豐度的真菌極有可能為冠突散囊菌。金花普洱茶中真菌組成譜呈現寡克隆性生長模式，曲霉屬真菌占據真菌組成譜中的99%，而且真菌物種多樣性顯著低于相應細菌多樣性，這可能是由于冠突散囊菌顯著抑制其他屬真菌生長造成的。

雖然變形菌綱（Gammaproteobacteria）和桿菌綱（Bacilli）是金花普洱茶中最具優勢的菌綱而且占比超過三分之二，但是在目、科和屬水平上，金花普洱茶的菌群分布差異較大。

綜上所述，金花普洱茶中富含曲霉屬真菌，極有可能為冠突散囊菌；同時富含假單胞菌屬，乳酸菌屬、大腸桿菌屬和鹽單胞菌屬等細菌，其中細菌物種多樣性超過真菌。

參考文獻

[1]張俊,陳文品,白文祥.普洱茶發展歷史三階段[J].中國茶葉,2004,26(1):35-37.

[2]王麗麗.普洱金花菌緊壓茶及制法[J].農村實用技術,2013(2):36-37.

[3]黃婧,楊民和.茯磚茶中“金花”菌的研究進展及應用潛力[J].福建茶葉,2013(1):7-12.

[4]馬燕,趙明,周玲,等.普洱茶樣中“金花”微生物的分離鑒定[J].茶葉通訊,2011,38(2):17-20.

[5]Hess M,Sczyrba A,Egan R,et al.Metagenomic discovery of biomass-degrading genes and genomes from cow rumen[J].Science,2011,331(6016):463-467.

[6]Qin J,Li R,Raes J,et al.A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing[J].Nature,2010,464(7285):59-65.

[7]Hubka V,Kolarik M,Kubatova A,et al.Taxonomic revision of Eurotium and transfer of species to Aspergillus[J].Mycologia,2013,105(4):912-937.