2型糖尿病合并急性胰腺炎大鼠腸道微生物ERIC-PCR指紋圖譜的分析

王永磊 ，蘇 峰 ，張 靜 ，楊彥文 ，張榮芳 ，倪 軍

糖尿病是一種以慢性血糖升高為重要特征的代謝、免疫性疾病，其病因及發病機制復雜，并發癥多。近年來隨著人們生活水平的不斷改善，DM的發病率也逐年升高，目前已成為與心腦血管病、腫瘤性疾病并稱的人類健康威脅最嚴重的三類疾病。美國、英國、中國臺灣等地的調查研究結果顯示，2型糖尿病患者與非糖尿病患者相比，急性胰腺炎發生率高出1.95～2.83倍[1-3]。糖尿病合并急性胰腺炎病情復雜、治療難度大，嚴重影響患者的身心健康，因此對糖尿病合并急性胰腺炎的研究具有重要的現實意義。Goto等[4]通過選擇處于糖耐量上限的Wistar大鼠近親繁育發現F13代時出現糖耐最受損，F30代時即存在穩定的糖尿病，即Goto-kakisaki自發性2型糖尿病大鼠（GK大鼠），這是一種自發性2型糖尿病模型。近年來，隨著分子生物學技術的高速發展，不依賴傳統微生物培養的基因指紋技術應運而生。腸桿菌基因間重復共有序列（enterobacteria repetitive intergenic consen sussequences，ERIC）是存在于多種細菌基因組中的串聯重復序列，研究發現該片段僅存在于腸道細菌基因組間[5]，在細菌噬菌體和質粒上尚未發現其存在。不同的細菌基因組上ERIC重復序列的數目及分布不同，利用ERIC核心序列設計反向引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，可得到一系列由大小不同片段組成的脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）指紋圖譜，即DNA遷移帶[6]。某種程度上，DNA遷移帶的灰度值和條帶數目代表著此重復序列間的距離和重復次數。因此，腸道菌群基因組DNA的差異可清晰顯示在指紋圖譜上，并可根據電泳條帶來區分菌株（型）。每個條帶可代表一種細菌類群，條帶的亮度可間接反映菌類數量，從而通過獲得的條帶數目和亮度信息分析混合菌群的多樣性[7,8]。本研究采用ERIC-PCR方法對Wistar大鼠及其急性胰腺炎造模組和GK大鼠及其急性胰腺炎造模組大鼠腸道微生物進行基因組DNA擴增，快速檢測并獲得菌群分布狀況，并與傳統細菌培養方法相結合，旨在得出更為準確的菌群定性結果，為糖尿病合并急性胰腺損傷相關基礎及臨床研究提供依據。

1 材料與方法

1.1主要實驗儀器PCR擴增儀CFX96 （美國Bio-Rad公司）、電泳儀DYCP-31DN（北京六一儀器公司）、紫外可見分光光度計Bio Spec-nano（日本島津公司）、酶標定量測定儀（德國Thermo公司）、制冰機XB70（美國GRANT公司）、Olympus BH2顯微鏡（上海兆儀光電科技有限公司）、EC3凝膠成像系統（美國UVP公司）。

1.2主要實驗試劑 牛磺膽酸鈉、戊巴比妥鈉購于Sigma公司；糞便DNA提取試劑盒購置于北京天根生物科技有限公司；大鼠胰淀粉酶試劑盒購自于上海酶聯生物科技有限公司。擴增引物由上海生工生物工程有限公司合成；柱式腐殖酸清除劑、PCR抑制物清除劑均購自于上海生工生物工程有限公司；PCR試劑盒、DNA Ladder（100～2 000 bp）、瓊脂糖等均購于碧云天生物科技有限公司。所有試劑均在有效期內使用。

1.3實驗動物及處理

1.3.1動物分組與造模 40只雄性10周齡大鼠（Wistar大鼠、GK大鼠各20只），無特定病原體級，購自于上海斯萊克實驗動物中心[許可證號：SCXK（滬）2012-0002]；飼養于新鄉醫學院生理實驗室清潔動物房[溫度（25±2）℃；濕度（50±10）%；12 h白晝/12 h黑夜輪換]，普通大鼠飼料適應性喂養2周。20只Wistar大鼠中隨機分為兩組，每組10只，空白對照組（QB組），標記為A1～A10；單純急性胰腺炎大鼠模型（AP組），標記為B1～B10。20只GK大鼠隨機分為兩組，每組10只，2型糖尿病組（DM組），分別標記為C1～C10；2型糖尿病合并急性胰腺炎動物模型（DAP組），分別標記為D1～D10。

術前禁食、水12 h；測體重，按比例0.15 ml/100 g給予3%戊巴比妥鈉溶液腹膜下注射麻醉，固定于手術臺上，備皮、消毒、鋪巾。無菌操作下做腹正中切口，約2.5 cm，逐層打開腹腔，提起胃，可見十二指腸通向肝臟方向的透明腺管，即膽胰管，近肝臟處用微型血管夾夾閉，近十二指腸處5號絲線結扎，其中AP組、DAP組逆行膽管注射法按體重比例0.1 ml/100 g緩慢勻速注射3.5%牛磺膽酸鈉溶液[9]；QB組、DM組同樣的方法按體重比例0.1 ml/100 g緩慢勻速注射0.9%氯化鈉注射液。注射完畢8 min后，取下微型血管夾，解除絲線結扎，將胃、十二指腸復位后，5號絲線結扎逐層縫合關閉腹腔。

1.3.2糖尿病合并急性胰腺炎造模成功納入與剔除標準納入標準：（1）采用酶聯免疫分析試劑盒檢測大鼠血清胰淀粉酶活性較術前升高3倍以上；（2）光鏡下采用改良Schmidt法對胰腺炎組織損傷進行定量評估達標[10]。剔除標準：（1）手術過程中死亡，或術后迅速死亡；（2）胰淀粉酶測試低于3倍；（3）病理切片評分未達標。

1.3.3實驗動物取材（1）術后24 h乙醚麻醉下，眼眥靜脈采血，1 000×g離心20 min，取上清液，凍存于-20 ℃冰箱。檢測造模組24 h血清胰淀粉酶活性水平和24 h隨機血糖，酶聯免疫吸附法檢測血清胰淀粉酶活性水平。（2）術后48 h處死大鼠，無菌操作下打開胸腔，暴露胰腺組織及胃腸，用生理鹽水沖洗后立即用4%中性多聚甲醛固定，4 ℃冰箱過夜，次日置換緩沖液。取橫切面的大鼠胰腺及部分結腸標本，經常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋處理后制作病理切片。每張切片厚5 μm，每間隔8張取1張做蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，光學顯微鏡下由來自新鄉醫學院第一附屬醫院及解放軍371中心醫院的兩位病理學專家對胰腺及小腸組織分別進行雙盲評分，胰腺組織損傷以改良Schmidt評價標準進行評分，用于驗證造模是否成功；無菌鑷取各組大鼠盲腸內新鮮糞便，用于基因組提取與細菌培養。

1.3.4糞便DNA基因組提取與處理 依據糞便基因組DNA提取試劑盒說明書（離心柱法）提取0.2 g糞便DNA基因組，并進行基因組擴增，將PCR產物點樣于瓊脂糖凝膠，制作目的ERIC-PCR指紋圖譜。

1.3.5腸道微生物培養1.0 g新鮮糞便放入無菌培養管中，加入10 ml滅菌水，充分振蕩混勻，用于細菌培養。無菌操作臺上，取振蕩好的糞便標本液1 ml加入裝有9 ml滅菌水試管中，按1×10-1～1×10-7的梯度做倍比稀釋，取稀釋后的溶液500 μl分別均勻涂布于BBL瓊脂培養基、MRS肉湯培養基，37 ℃厭氧培養48 h；SS瓊脂培養基，MAC培養基37 ℃需氧培養24 h。形態學和生理生化特性鑒定：根據《柏杰氏細菌鑒定手冊》對所得菌群進行形態和生理生化測定，并按可數性原則對培養平板進行菌落計數，記錄每組選擇性培養基平皿中的菌落數（cfu），計算每克新鮮糞便中的細菌數，并取對數轉換（l g10 n/g）。

1.3.6制作ERIC-PCR指紋圖譜 通過參考相關文獻[11]及反復試驗最終確定PCR初始反應體系，見表1；引物序列ERIC-1 5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'；ERIC-2 5'-AAGTAAG TGACTGGGGTG AGCG-3'反應條件：（1）95 ℃預變性8 min；（2）95 ℃變性30 s，52 ℃退火1 min，65 ℃延伸8 min，32個循環；（3）65 ℃終延伸16 min。PCR結束后，8 h內取PCR產物5 μl點樣于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓5 V/cm，30 min；紫外凝膠成像儀檢測并拍照。將采集的數據代入Shannon-Wiener（H）公式[12]H=-∑（ni / N）ln（ni / N）（其中ni是第i條Eric條帶數目，N代表所產生的所有Eric條帶的峰下面積[13]）。

表1 PCR初始反應體系

1.4統計學處理 應用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計量資料以x±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較，當方差齊時，采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；當方差不齊時，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，進一步兩兩比較采用Nemenyi檢驗。以雙側P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1大鼠一般情況 （1）實驗期間，DAP組出現4只死亡，AP組2只死亡，死亡大鼠經解剖發現其中5只存在大量胸腔積液、胰腺組織嚴重壞死，1只死因不明；QB組、DM組大鼠均無死亡；（2）對4組大鼠攝食情況觀察發現：AP組、DAP組大鼠幾乎不進食，少量飲水；QB組、DM組術后少量進食水（約每只20 g/d標準飼料）；（3）對各組大鼠活動能力及靈敏度觀察：術后24 h，4組大鼠活動能力和反應靈敏度均不同程度減弱，其中DAP組活動能力及對疼痛刺激靈敏度最差，DM組和QB組差別不明顯。術后48 h，AP組、DAP組大鼠活動能力和反應靈敏度進一步減弱，而QB組和DM組大鼠活動度和反應靈敏度較24 h明顯加強；（4）DAP組、AP組大鼠出現不同程度的腹脹、便秘，而QB組、DM組未發現腹脹、腹瀉癥狀。

2.2 4組大鼠病理評分 按大鼠炎性反應的嚴重程度，對4組大鼠病理切片按Schmidt胰腺組織評分標準評分發現，AP組和DAP組的病理學評分較QB組升高，而DAP組評分高于AP組。DAP組胰腺組織水腫和炎性細胞浸潤程度較AP組加重并出現明顯的胰腺組織溶解壞死；DM組呈現輕微炎性反應狀態，評分較AP組、DAP組降低，而QB組大鼠胰腺組織無明顯變化，見圖1。

圖1 4組大鼠Schmidt胰腺組織病理評分比較

2.3術后24 h血糖及血清淀粉酶 DAP組術后24 h血糖水平（19.4±2.5）mmol/L，較AP組的（17.7±2.0）mmol/L升高，差異具有統計學意義（t=2.24,P＜0.05）；DAP組術后24 h血淀粉酶水平（1786.7±108.8）U/L，較AP組的（1756.7±66.7） U/L無明顯變化，差異無統計學意義（t=6.40,P=0.53）。

2.4 4組大鼠腸道菌群多樣性指數 通過Gel-Pro Application軟件，將4組大鼠ERIC-PCR圖譜轉變為波峰圖，每1個波峰代表1條ERIC帶，峰下面積代表條帶亮度。4組大鼠腸道菌群多樣性指數比較，AP組、DAP組較QB組多樣性指數降低；與AP組相比較，DAP組腸道菌群多樣性指數進一步降低，見圖2。

圖2 4組大鼠菌群多樣性指數比較

2.5 4組大鼠腸道微生物ERIC-PCR指紋圖譜的分析及相似性聚類分析 4組不同大鼠糞便中提取的基因組DNA經PCR儀擴增后，每組均可擴增出6～18條不同的片段，所有特征性條帶分布于100～2 000 bp，其中85%的特征性條帶分布于200～1 500 bp。QB組特征性條帶數目總數明顯多于其他3組，特征性條帶亮度相對均一，DM組次之，DAP組最差；DAP組特征性條帶減少，200～500 bp部分條帶亮度減弱，800～1 500 bp條帶的亮度增強；DAP組與DM組比較特征性條帶數量減少，200～500 bp處部分條帶亮度減弱，800～1 100 bp條帶的亮度增強。將4組大鼠ERIC-PCR指紋圖譜進行相似性聚類分析比對，QB組與其他3組有較明顯的差異，而AP組、DAP組比較靠近，但又存在一定的差異，見圖3。

2.6腸道微生物菌群計數結果及比較 4組間腸道微生物菌群比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，DAP組的雙歧桿菌和乳酸桿菌低于QB、AP組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；DAP組的大腸桿菌和變形桿菌高于QB、AP組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

3 討 論

人體的神經系統、內分泌系統、免疫系統與各種體內微生物存在著非常復雜的聯系[14]。糖尿病是內分泌、免疫系統最重要的疾病之一，而腸道是人體內最大的應急場所，腸道菌群的數目、種類遠比目前發現的要多，其基因總量是宿主本身基因量的150倍以上[15]，腸道微生態也被稱為“第二基因組”。 腸道菌群不僅可以通過基因編碼等多種機制參與宿主的能量代謝，還可為人體提供維生素、必需氨基酸、抗菌素和多肽等營養物質，分解體內一些有毒有害代謝物質，如亞硝胺、硫化氫和乳酸等，參與人體腸上皮的生長、分化、炎性反應等[16]。

近年來研究表明，腸道微生態與糖尿病、胰腺炎等多種疾病的發生發展密切相關，糖尿病患者機體長期處于一種慢性炎性狀態[17]，而當發生急性胰腺炎時腸道微生態失調，腸黏膜的免疫功能可放大胰腺組織及全身的炎性反應，使輕癥迅速發展至重癥；而當發生急性胰腺損傷時，胰腺組織局部微循環障礙，胰島素分泌減少，增加了糖尿病酮癥的風險。糖尿病和急性胰腺炎兩者互為因果，使該類疾病病情發展迅速，患者病死率高，嚴重威脅其生命安全。國外研究表明，糖尿病患者CCK-A受體表達受到抑制，也可使膽囊運動減弱胰腺炎患者死亡的重要原因就是多功能臟器衰竭[18]，目前諸多數據已經表明，胃腸功能障礙是胰腺炎并發感染及多系統器官衰竭的重要促發因素，胰腺炎加重的重要原因。糖尿病患者免疫功能較正常人明顯降低，抗炎細胞減少，內環境功能紊亂，輕微的外界環境改變即可導致感染發生，進一步觸發炎性因子大量釋放，在IL-8趨化作用下，中性粒細胞可聚集于胰腺組織[19]，導致急性胰腺炎的發生。

血、尿淀粉酶測定是臨床診斷急性胰腺炎較為常用的檢驗方法，兩者特異性強但敏感性較差，不能有效對急性胰腺炎做出快速診斷[20]。因此，了解糖尿病合并急性胰損傷大鼠的微生態參與的相互作用，探索快速有效的檢測方法，對此疾病的診斷有重要的作用，可為臨床糖尿病合并急性胰腺炎的治療爭取寶貴時間。

圖3 4組大鼠腸道微生物ERIC-PCR指紋圖譜及相似性聚類分析圖

表2 4組腸道優勢菌群菌落計數情況（x ±s，l g10n/g）

本研究采用3.5%牛磺膽酸鈉胰膽管逆行注射法，制作急性胰腺炎大鼠模型，是比較成熟的造模方法，其在發病機制及病變等方面與人類臨床糖尿病合并急性胰腺炎相似且方法穩定簡便、成功率高[21]。ERICPCR樣品的前期處理和DNA提取過程會影響PCR技術的重復性、準確性和特異性，并且PCR技術本身存在一個樣本的檢出限，所以糞便基因組提取過程及PCR反應條件的優化，對實驗的順利進行起到至關重要作用，本研究在參考既往研究成果的基礎上，反復試驗，優化PCR反應條件，最終得到較為清晰的圖像[22]。

正常的腸黏膜物理屏障由黏液層腸黏膜上皮細胞和細胞間的緊密連接等構成。腸黏膜上皮細胞通過不斷更新來保持腸黏膜屏障的完整性，嗜酸乳桿菌與雙歧桿菌是腸道主要的益生菌，雙歧桿菌屬等專性厭氧菌定植于黏膜上皮細胞表面，能夠阻止條件致病菌（如大腸埃希菌）對腸黏膜的黏附和定植，具有免疫調節、抗炎、抗癌、降血脂等方面的作用[23]。急性胰腺炎時腸道屏障的動態平衡被打破，腸麻痹導致腸蠕動減弱，腸道內容物堆積，脫落的細菌不能被及時排出體外，機會致病菌過度繁殖，腸道屏障受損，腸道通透性增加，細菌易發生遷移，打破腸道微生物動態平衡。既往研究發現，重癥急性胰腺炎時，大量增殖的大腸埃希菌等條件致病菌通過受損的腸黏膜屏障進入腹腔定植于臟器表面導致腹膜及腹腔臟器感染，并通過擴張的毛細血管進入血液導致內毒素血癥及多臟器感染及腸黏膜屏障損害，而且腸道微生態與細菌移位之間相互促進導致惡性循環是成為全身多臟器感染的環節之一[24]。腸道病理評分及死亡大鼠解剖顯示DAP組大鼠腸黏膜屏障遭到破壞，腸黏膜絨毛變短、壞死、脫落、絨毛間質水腫、固有膜水腫伴大量炎性細胞浸潤、腸壁通透性增加這與文獻[25]的研究結果相符。

本研究證實了糖尿病合并急性胰腺炎大鼠腸道微生物ERIC-PCR指紋圖譜條帶多樣性發生明顯改變；并通過傳統細菌培養法得到了驗證。GK大鼠在發生急性胰腺炎前后，腸道菌群發生了明顯的變化，GK大鼠并發急性胰腺炎前后的擴增條帶有顯著的多樣性差異，聚類分析結果同樣得到了證實；DAP組與AP組大鼠相比較，DAP組大鼠腸道菌群多樣性指數進一步降低，表明2型糖尿病是急性胰腺炎加重的原因之一。GK大鼠發生急性胰腺炎損傷后，由于其菌群多樣性變化，GK大鼠造模前后其指紋圖譜發生明顯的變化，在圖譜上表現為條帶數目減少，菌群多樣性的降低，說明急性胰腺炎可使腸道菌群發生明顯改變，這與筆者利用傳統細菌培養法培養腸道微生物得到結果相符。將4組大鼠ERIC-PCR指紋圖譜進行聚類分析對比后發現，QB組與其他3組有較明顯的差異，而AP組、DAP組比較靠近，又有一定的差異；本研究發現，糖尿病大鼠在發生急性胰腺炎前后，腸道菌群發生了明顯的變化，乳酸桿菌、雙歧桿菌數量減少，而有大腸桿菌、變形桿菌數量不同程度的增加，同時筆者還發現，除了上述菌群外，還有很多未培養出來的菌群改變，表現在ERIC-PCR指紋圖譜上為條帶數量的減少，即菌群多樣性降低；盡管目前尚不清楚菌群多樣性的改變對糖尿病大鼠發生急性胰腺胰腺損傷有多大危害，但可推測在糖尿病發病過程中，益生菌的減少、條件致病菌的增多可能增加了糖尿病并發急性胰腺炎的風險，因此，筆者團隊推測腸道菌群的改變在糖尿病并發急性胰腺炎的發生、發展過程中起到了一定的作用。

總之，本研究發現2型糖尿病大鼠并發急性胰腺炎后腸道菌群的結構均發生改變，菌群多樣性減少；益生菌減少及條件致病菌的增多，腸道菌群的改變可增加并發急性胰腺損傷的風險，并且是胰腺炎進一步加重的重要影響因素；腸道菌群的變化參與2型糖尿病合并急性胰腺炎的病程進展，關注腸黏膜屏障的修復并糾正腸道菌群失調可能對該類疾病的轉歸及預后有一定價值。

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