不同劑量人參皂甙Rb1對大鼠脊髓缺血再灌注損傷及survivin的作用

程斌，宋煥瑾，李鋒濤，林磊，薛建利，吳昊，葉勁濤

1.西安交通大學醫學院第二附屬醫院骨科，陜西西安市710004；2.漢中市中心醫院骨科，陜西漢中市723000

在早期研究中，人們認為缺血是組織損傷、壞死的主要原因，但隨著研究深入，發現在缺血一段時間后，如果組織供血恢復，該組織的損傷程度與單純缺血相比更為嚴重，此即組織的缺血再灌注損傷。多種原因可以導致脊髓缺血再灌注損傷，如脊柱創傷、血管外科手術等。

大多數研究認為，神經組織缺血再灌注損傷沒有有效治療方法，目前主要使用大劑量糖皮質激素和神經營養藥物等治療[1]。對脊髓缺血再灌注損傷機制的研究集中在炎癥損傷、氧化應激、自由基損傷、興奮性中毒、能量物質缺乏及細胞凋亡等方面，目前認為細胞凋亡是造成損傷的主要機制[2]。

凋亡是重要的生理過程，在促凋亡機制及抗凋亡機制之間存在精確的平衡。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)作為抗凋亡蛋白家族成員，可以抑制caspase凋亡信號途徑，在許多物種的凋亡調控中起重要作用[3]。人類的8種凋亡抑制蛋白已被廣泛研究，其中survivin可以抑制procaspase-3/procaspase-7或caspase-3/caspase-7的活性，抑制凋亡[4]。

人參皂甙Rb1屬于人參二醇，具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤等作用[5]。本研究探索survivin蛋白和脊髓缺血再灌注損傷之間的關系，以及不同劑量人參皂甙Rb1治療脊髓缺血再灌注損傷的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級成年健康Sprague-Dawley大鼠，體質量(213±15)g，購于西安交通大學醫學院實驗動物中心。

將實驗動物分為假手術組、模型組和藥物D10、D20、D40、D80組，藥物各組劑量分別為10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、80 mg/kg，每組12只。

1.2 主要儀器及試劑

TUNEL試劑盒：南京建成生物工程研究所。survivin單克隆抗體：美國SANTA CRUZ公司。SP免疫組化試劑盒、DAB試劑：北京博奧森生物技術有限公司。多聚甲醛：天津化學試劑廠。人參皂甙Rb1粉劑：中國藥品生物制品檢定所。HE染液：溫州康泰生物科技有限公司。苯巴比妥鈉粉劑：美國SIGMA公司。

1.3 造模方法

動物術前禁食一夜，自由飲水。3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，保持自主呼吸。動物置于恒溫毯上，肛溫探頭置入肛門，保持大鼠體溫37.1～37.5℃。頸正中切口，顯露左頸總動脈，置入PE50導管并連接于放血裝置及監護儀，監測近端動脈壓及心率；在大鼠尾中段上1/3顯露尾動脈，置入PE50導管并連接監護儀，監測遠端動脈壓。左腹股溝切口，顯露左股動脈，遠端結扎后輕微牽拉，近端剪一切口，將Fogarty導管經股動脈置入至胸主動脈高度，立即給予200 U肝素鈉，用注射器推入生理鹽水0.05 ml，避免球囊松弛。立即打開放血裝置放血，在1 min內將近端平均動脈壓降至45 mmHg，記錄血壓及放血量。10 min后，松開球囊，立即勻速回輸放血裝置內的血液，回輸時間控制在1 min左右。

術后監測血壓l0 min后取出動脈插管，結扎動脈，皮下注射硫酸魚精蛋白4 mg。動物置25～30℃保溫箱內，等待動物蘇醒后放回飼養籠中。

藥物組大鼠于脊髓缺血前30 min腹腔注射相應劑量人參皂甙Rb1，術后每天腹腔注射相同劑量人參皂甙Rb1。

實驗中意外死亡大鼠，隨機另取大鼠補充。

1.4 BBB評分

造模后48 h，各組大鼠行BBB評分。評分人員為未參加本組實驗而熟悉評分標準的人員。

1.5 標本采集

BBB評分后，心臟采血3 ml，室溫放置2 h后，1000 r/min離心10 min，取血清，置于-20℃冰箱保存。心臟采血后，予3%苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，升主動脈插管，剪開右心房，快速灌注生理鹽水250 ml后，繼續灌注4%多聚甲醛至右心房流出清亮多聚甲醛、尸體僵硬。立即取出腰段脊髓1 cm，4℃ 4%多聚甲醛后固定24 h，自來水浸洗24 h，石蠟包埋，于L3節段2 mm范圍內連續切片，厚10 μm。

1.6 HE染色

取各組脊髓組織石蠟切片行HE染色。

1.7 免疫組織化學染色

各組脊髓組織石蠟切片脫蠟，梯度乙醇和蒸餾水復水，3%H2O2孵育30 min，滴加5%BSA封閉液，室溫20 min，滴加survivin一抗(1∶100)，濕盒內4℃過夜。滴加生物素化二抗工作液，室溫20 min；滴加SABC，室溫15 min。DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化。采用高清晰彩色醫學圖文分析系統，每張切片取5個不同視野拍片，進行圖像分析，計數脊髓前角survivin陽性神經元。

1.8 TUNEL檢測

石蠟切片脫蠟及復水同前，使用PBS液處理。采用高清晰彩色醫學圖文分析系統，每張切片隨機取5個不同視野拍片，進行圖像分析，計數脊髓前角TUNEL陽性神經元。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 BBB評分

模型組BBB評分較假手術組下降(P＜0.05)。各藥物組BBB評分雖較假手術組降低(P＜0.05)，但比模型組高(P＜0.05)。隨著藥物劑量的增大，評分也相應增高，但D40組與D80組相差不大。見表1。

2.2 HE染色

假手術組脊髓神經元胞漿內尼氏體清晰可見；模型組神經元皺縮，尼氏體模糊且數量減少，脊髓組織出現大小不一的空泡變性；各藥物組均可見損傷性改變，但損傷程度較模型組輕。見圖1。

2.3 免疫組化及TUNEL染色

模型組脊髓前角survivin蛋白陽性細胞較假手術組增多(P＜0.05)，TUNEL陽性細胞增多(P＜0.05)。各藥物組survivin蛋白陽性細胞較模型組增多(P＜0.05)，TUNEL陽性細胞數減少(P＜0.05)。隨著藥物干預劑量增大，survivin蛋白陽性細胞數增多，TUNEL陽性細胞數減少，但D40組與D80組相差不大。見表1、圖2、圖3。

survivin蛋白陽性細胞數與TUNEL陽性細胞數呈負相關性(r=-0.601,P＜0.05)。

圖1 各組脊髓HE染色(400×)

圖2 各組脊髓survivin免疫組化染色(400×)

表1 各組BBB評分、脊髓survivin陽性細胞計數、脊髓TUNEL陽性細胞數比較

3 討論

本研究顯示，大鼠脊髓缺血再灌注損傷可使脊髓前角survivin陽性細胞數增多；予人參皂甙Rb1干預后，survivin陽性細胞數繼續增多，并隨藥物劑量增大而增加，但大于40 mg/kg后，這種趨勢不再明顯。這種變化與大鼠脊髓前角神經細胞凋亡數呈負相關。

survivin由142個氨基酸構成，其N-端桿狀病毒IAP重復結構(baculorius-IAP repeat,BIR)域可抑制procaspase-3/procaspase-7或caspase-3/caspase-7的活性，抑制凋亡；C-端沒有其他IAP家族成員所具有的環指狀結構。survivin單體通過BIR域相互聚集，結合成對稱二聚體，這種結構為survivin抗凋亡所必需。survivin的分布具有細胞選擇性，在胚胎及胎兒組織器官中高度表達。但成人除了胸腺、腎臟、胎盤、睪丸等終末分化組織外，并無表達。目前多數研究著眼于肝癌、肺癌及淋巴瘤等腫瘤方面的研究[4]，僅有少量研究提示，survivin可在腦細胞缺血再灌注損傷后表達升高[6]。survivin可以與X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)結合，形成survivin-XIAP復合物，促進XIAP穩定性并協同抑制caspase-9，發揮細胞保護作用。也有文獻指出[7]，survivin不能通過與XIAP結合抑制凋亡。survivin可以在凋亡過程中，特異性調節線粒體內膜蛋白Smac/Diablo的釋放，還通過與Smac/Diablo結合，延遲其釋放[8]。現有研究發現，脊髓缺血再灌注損傷后，細胞凋亡主要發生在前角，但具體機制尚不清楚[9]。

人參皂甙是人參的主要活性成分。人參的根莖中含有2%～3%人參皂甙，主要是Rg1、Rc、Rd、Re、Rb1、Rb2及Rb0。西洋參人參皂甙含量最高。人參皂甙有與糖基鏈接4環甾類結構，迄今已從西洋參根莖種發現并分離出超過40種人參皂甙。每種人參皂甙至少含有2個(C-3及C-20)或3個(C-3、C-6及C-20)羥基基團，羥基集團可以不與糖基相連，也可以單體、二聚體或三聚體形式與糖基相連。由于C-20位羥基基團的位置存在變化，所以人參皂甙同樣具有立體異構體。根據人參皂甙的分子結構，可以將其分為人參二醇(protopanaxadiol,PD)及人參三醇(protopanaxatriol,PT)兩類。PD包括Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、Rh2及Rh3，其糖基與3-位達瑪烷型三萜相連。PT包括Re、Rf、Rg1、Rg2及Rh1，其糖基與6-位達瑪烷型三萜相連[10]。偽人參皂甙F11屬于PT，其碳鏈20位C被四氫呋喃環所取代。25-OH-PPD及25-OH-PPT等新發現的人參皂甙從人參的果實中分離出來，具有明顯抗癌作用[11]。人參皂甙Rb1、Rb2、Rc及Rd的4種丙二酰基衍生物也被發現。Ro及這些丙二酰基衍生物也被稱為酸性人參皂甙，而其他人參皂甙被稱為中性人參皂甙。

人參皂甙Rb1屬PD，具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老作用，可以有效阻斷超氧陰離子生成，并下調內皮型一氧化氮合酶。人參皂甙Rb1對缺血性腦損傷有保護作用，在腦缺血后自由基大量生成時，可作為自由基清除劑發揮作用[12]。人參皂甙Rb1可通過蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)信號傳遞途徑使突觸磷酸化，從而促進神經遞質的釋放[13]。人參皂甙Rb1是糖皮質激素受體及雄激素受體的配體，作為激動劑可以促進離子快速內流及一氧化氮生成[14]。人參皂苷還能通過影響身體內某些微生物間相互轉化，達到抗炎、抗菌作用[12,15]。

在動物實驗中，人參皂甙可以抑制血小板聚集。人參皂甙可以促進血小板cAMP水平升高，降低血栓素A2的生成及釋放，抑制前列環素生成。人參皂甙干預8周，可以延遲主動脈粥樣硬化斑塊的形成。人參皂甙Rb1以劑量依賴方式，促進綿陽紅細胞葡萄糖攝取；人參皂甙Rb2可以通過促進糖酵解酶的活性，調節胰島素的分泌及糖代謝。人參皂甙Rg1及Rb1可促進大鼠大腦皮層神經末梢谷氨酸釋放，對學習、記憶等認知功能有促進作用。在動物實驗中，人參皂甙對某些疾病及反應具有保護或抑制作用[16-17]。人參皂甙Rb1對缺血性腦損傷及螺旋神經節細胞損傷具有保護作用，其作用類似于親神經因子[18]，提示人參皂甙可能對帕金森病及阿爾茨海默病等神經變性疾病有治療作用[19]。人參皂甙Rd具有免疫佐劑作用，可以通過調節Th1及Th2細胞因子的基因表達等作用，誘導Th1及Th2細胞免疫反應。在大鼠血管性癡呆模型中，人參皂甙Rg2可通過抗凋亡，保護記憶功能；可能對血管性癡呆及其他缺血性損傷有治療意義[20]。人參皂甙Rg2還對病毒感染造成的細胞壞死有保護作用[21]，通過自噬糾正由于細胞能量代謝異常導致的脂肪堆積[22]。

本研究顯示，在大鼠脊髓缺血再灌注損傷過程中，人參皂甙Rb1可通過促進survivin表達，抑制凋亡等途徑發揮保護作用。在10～40 mg/kg劑量范圍內，其保護作用隨劑量增大而增強。這為人參皂甙Rb1在臨床上的應用提供了動物實驗基礎。

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