推拿聯合跑輪訓練對大鼠失神經骨骼肌萎縮的效果①

馬穎，嚴雋陶，馬書杰，陸永嘉，王春紅，史智君，陶然，孔亞敏

1.上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院推拿科，上海市200437；2.上海中醫藥大學，上海市201203

骨骼肌損傷在生活、運動中常見[1]。神經損傷后，患者進入慢性肌肉廢用性肌病的惡性循環，引起肌肉萎縮、無力和疼痛等臨床表現[2]。骨骼肌失神經支配后，如果不能及時獲得神經再支配，骨骼肌將發生不可逆性萎縮，甚至導致功能喪失[3]。傳統推拿手法常與主動運動配合，作為周圍神經損傷的康復方法。本研究觀察推拿手法聯合跑輪訓練對大鼠坐骨神經橫斷傷模型失神經骨骼肌萎縮的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1月齡Sprague-Dawley大鼠80只，體質量180～200 g，雄性，由上海斯萊克實驗動物公司提供，許可證號SCXK(滬)2012-0002。實驗前1周于上海中醫藥大學動物實驗中心適應性飼養，許可證號SYXK(滬)2014-0008。自由飲食，室溫18℃，濕度(45±5)%。

采用計算機隨機分組，將大鼠分為對照組(n=40)和手法組(n=40)，每組大鼠按取材時間不同，再分為4個小組，每小組10只。

1.2 主要試劑及儀器

10%水合氯醛：上海西唐生物科技有限公司。石蠟、甲醛、氨水、二甲苯、無水乙醇、30%H2O2：上海國藥集團。DAB濃縮試劑盒、廣譜二抗：上海長島生物技術有限公司。胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-like growth factorⅠ,IGF-Ⅰ)、抗PCNA工作液：ABCAM公司。ABC試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。蘇木素、中性樹脂：北京索寶萊科技有限公司。CX41正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司。IMS圖像分析系統：基爾頓生物有限公司。電子天平：江蘇衡器廠。YLS-15A大鼠轉輪式跑步機：成都儀器廠。自制手法模擬儀：本校與上海復旦大學共同研制。

1.3 模型制備

采用坐骨神經橫斷傷模型。大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，備皮，常規消毒，無菌條件下臀部切口，于坐骨結節下方0.5 cm處顯露右側坐骨神經干并鈍性分離，距梨狀肌下緣1 cm處切斷坐骨神經干，兩斷端返折180°后分別縫入附近肌組織。縫合肌間筋膜與皮膚。術后碘伏消毒切口，傷口灑入適量注射用青霉素鈉粉針，縫合傷口。

1.4 干預方法

手法組于術后21 d開始治療。采用自制推拿手法模擬儀模擬捏法治療，壓力6 kPa，捏2 min暫停1 min，120次/min，共5 min。采用YLS-15A大鼠轉輪式跑步機進行主動運動訓練，0.65 m/轉，5 r/min，共5 min。每天1次。

對照組不做干預。

1.5 取材及檢測

各組分別在干預后1、2、3、4個月各取10只大鼠進行檢測。

1.5.1 腓腸肌濕重比

大鼠10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，剝離并完整取下雙側腓腸肌，迅速放于電子天平上稱量，記錄右側/左側質量比。

1.5.2 肌衛星細胞計數

腓腸肌組織修切成小塊，10%福爾馬林液中固定24 h。梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，厚6 μm。切片脫蠟、漂洗、脫水、透明、封片。PCNA染色，400倍光學顯微鏡下觀察不相交但相鄰的10個視野，計數PCNA陽性細胞數。

1.5.3 免疫組化染色

腓腸肌組織福爾馬林液中固定48 h，洗滌、脫水、浸蠟包埋。切片，厚6 μm。切片脫蠟、脫水，抗原修復。玻片置3%H2O2中，濕盒孵育10 min，0.02 mol/L PBS沖洗3 min，共3次；滴加IGF-Ⅰ一抗，濕盒孵育，室溫下放置1 h。0.02 mol/L PBS沖洗3 min，共3次；滴加二抗并孵育20～30 min，0.02 mol/L PBS沖洗3 min，共3次；蘇木素染色，透明并封片。400倍光學顯微鏡下，觀察不相交但相鄰的10個視野，計數IGF-Ⅰ陽性細胞數。

1.5.4 HE染色

如免疫組化流程制做切片，烤片、脫蠟、水化，蘇木精染色、伊紅染色，透明、封片，顯微鏡下觀察。

1.6 統計學分析

采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析。數據服從正態分布，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 腓腸肌濕重比

腓腸肌濕重比總體呈下降趨勢，干預3個月，對照組肌濕重比高于手法組(P＜0.05)；干預4個月，手法組肌濕重比有高于對照組的趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組干預不同時間點腓腸肌濕重比比較

2.2 肌衛星細胞數

兩組腓腸肌衛星細胞數干預后2個月開始持續升高，手法組在干預后3個月，肌衛星細胞數明顯高于對照組(P＜0.01)。見表2。

表2 兩組干預不同時間點肌衛星細胞數比較

2.3 IGF-Ⅰ表達

兩組干預后，腓腸肌IGF-Ⅰ表達呈上升趨勢，從干預2個月開始，手法組IGF-Ⅰ陽性細胞數高于對照組(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組干預不同時間點IGF-Ⅰ陽性細胞數比較

2.4 HE染色

干預1個月時，兩組大部分肌纖維斷裂，橫紋模糊或消失，肌細胞扭曲。2個月時，對照組間質中成纖維細胞增生，脂肪變性；手法組肌纖維排列尚可，出現大量肌衛星細胞，間隙較1個月時有好轉，仍有肌纖維斷裂。3個月時，對照組肌纖維排列致密紊亂，部分肌纖維斷裂；手法組細胞核增多、聚集，部分肌纖維退變和斷裂，部分區域間質疏松。4個月時，對照組細胞核增多、聚集，間質中成纖維細胞增生；手法組部分肌纖維斷裂，肌纖維排列較為整齊，間隙較3個月時變窄。見圖1。

3 討論

骨骼肌萎縮引起肌力和耐力喪失，肢體活動受限，損害生活質量，加劇跌倒和骨折風險，引發進一步肌肉萎縮。后期，肌肉萎縮導致虛弱和獨立生活喪失，給患者家庭和整個社會造成巨大負擔[4]。失神經骨骼肌萎縮的防治關鍵是促進神經再生[5]。指導患者進行正確、適當的運動訓練，是促進受損神經再生、恢復肢體功能的有效方法[6]。

推拿能促進肌衛星細胞增殖，調節相關生肌因子的表達[7-9]，促進快肌纖維恢復，使失神經后骨骼肌結構形態改善，延緩骨骼肌萎縮[10]。推拿可促進大鼠周圍神經損傷后行為學、形態學恢復[11]，通過促進內源性因子及相關蛋白表達，促進神經再生及功能恢復[12-13]。

周圍神經損傷后，康復訓練對靶器官功能恢復十分重要。耐力運動如跑臺訓練，可調節損傷后細胞和分子反應，增加再生神經元和軸突生長的速率和程度，促進周圍神經損傷后神經再支配[14]。失神經支配期間，跑臺訓練能促進血液循環，直接改善肌肉營養，促進肌肉恢復，增加等長肌力[15-16]。

骨骼肌是周圍神經系統的靶器官。失神經支配導致肌肉質量下降，肌肉纖維變形[17]。當損傷涉及下運動神經元時，萎縮特別嚴重，肌肉組織會經歷纖維化和脂肪替代，從而產生失神經的退化肌肉[18]。

本研究顯示，骨骼肌失神經支配后，肌肉出現明顯萎縮，肌濕重比最多可減少60%左右。治療組干預3、4個月時，肌濕重比有所回升，趨于平穩；對照組3個月時肌濕重比上升較多，但4個月時又有所下降。多數時期，兩組肌濕重比無顯著性差異，說明手法聯合跑輪訓練不能從根本上阻止失神經骨骼肌萎縮的趨勢。

圖1 兩組腓腸肌HE染色

骨骼肌含有少量單核的干細胞，稱為肌衛星細胞，占肌細胞核總數2%～10%[19]。肌衛星細胞有強大的再生能力，正常情況下處于靜息狀態；肌肉損傷后，肌衛星細胞被激活增殖，并表達肌原性調節因子，產生肌源性祖細胞。肌源性祖細胞能與原有肌纖維融合，也可互相融合，使肌肉再生[20-21]。即使多次創傷后，肌衛星細胞數也保持不變[22]。肌衛星細胞適當地平衡靜止、自我更新和復制能力，對于骨骼肌再生至關重要。以往研究發現，骨骼肌失神經支配4個月后，肌衛星細胞數量極少，導致肌肉萎縮不可逆；失神經2～3個月時再神經化，肌衛星細胞增殖，促使肌功能恢復[23]。

本研究顯示，干預3個月時，肌衛星細胞快速增殖，高于對照組；4個月時兩組數目趨于相等。與既往研究一致，說明手法聯合跑輪訓練能夠促進肌衛星細胞增殖，進而促進失神經骨骼肌再生，延緩肌萎縮。

肌衛星細胞的激活與成肌分化受生長因子、激素、成肌調控因子等多種因素影響。IGF-Ⅰ是肌衛星細胞增殖和骨骼肌干細胞終末分化的重要調節因子[7]。IGF-Ⅰ作為肌肉生長正向調節信號，是刺激肌衛星細胞增殖、重塑肌肉的重要細胞因子[24]。它促進機體生長發育、參與組織修復，對促進骨骼肌蛋白質合成有顯著作用[25]。

本研究顯示，干預2～4個月時，兩組IGF-Ⅰ表達均增長，手法組高于對照組。我們推測，手法聯合跑輪訓練能夠促進IGF-Ⅰ的表達，進而使肌衛星細胞增殖，延緩失神經骨骼肌萎縮。

綜上所述，推拿手法聯合跑輪訓練對大鼠失神經骨骼肌萎縮有一定作用，可能通過促進相關生長因子的表達，促進肌衛星細胞增殖與分化實現。但骨骼肌再生是一個復雜的調控過程，推拿延緩骨骼肌萎縮的機制和途徑還需要進一步深入研究。

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