KCNQ1基因7個位點單核苷酸多態性與糖尿病前期人群運動干預敏感性的關聯①

夏小慧，王卉，張社平，夏惠蕓

1.蘭州城市學院體育學院，甘肅蘭州市730070；2.井岡山大學體育學院，江西吉安市343009；3.國營長風機器廠職工醫院，甘肅蘭州市730070

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是一種代謝型疾病，發病與遺傳和環境密切相關。闡明T2DM易感基因及其與環境因素、生活因素的相互作用機制，是科學防治T2DM的重要前提。

糖尿病前期又稱糖調節受損，是從糖代謝正常發展為T2DM的過渡階段，也是可以逆轉糖尿病發生的階段。在這一階段采取有效干預措施，對預防糖尿病具有重要意義。

運動干預是防治糖尿病的重要非藥物手段。目前運動干預的方式主要有有氧運動和抗阻運動，這兩種方式均能改善糖尿病患者及糖尿病前期人群異常血糖代謝。但由于遺傳差異，運動干預效果有所不同。在糖尿病前期人群中，約1/5個體不能從運動中獲益[1]。檢測運動干預對糖尿病前期人群糖脂代謝的敏感性，可為制定糖尿病前期人群運動干預個體化處方提供依據。

電壓門控鉀通道Q亞家族成員1(voltage-gated potassium channel subfamily member 1,KCNQ1)基因是Yasuda等[2]通過全基因組關聯分析法，在亞洲人群中確定的T2DM易感基因。該基因在不同種群中分布有很大差異，其編碼的電壓門控鉀通道蛋白在血管平滑肌、胰腺組織高表達，參與糖尿病血管并發癥的發生，并可能參與糖尿病的原發病變[3]。KCNQ1基因基因區的多個多態位點與糖尿病發生有關[4-6]。

本研究從KCNQ1基因區選擇標簽單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點，觀察SNP基因型和單體型與糖尿病前期人群有氧運動干預敏感性的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從2015年1月30日起，在國營長風機器廠社區活動中心招募受試者，并經過初篩和復篩。初篩時測空腹血糖并進行口服糖耐量試驗，篩選出符合美國糖尿病協會制定糖尿病前期糖調節受損(impaired glucose regulation,IGR)標準的人群，包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose,IFG)、葡萄糖耐量受損(impaired glucose tolerance,IGT)或IFG/IGT人群，對未進行藥物治療并自愿參加運動干預者進行復查。兩次篩查均符合IGR診斷標準的受試者，完成健康體檢，經專科醫生診斷無運動測試禁忌癥者，建立健康檔案并簽署知情同意書，進行觀察。最終納入受試者70例。在試驗過程中，4例因個人身體原因退出，最終完成測試者66例。

本研究經醫學倫理委員會審查通過。

1.2 研究方法

1.2.1 指標測定

在運動干預前后，同一條件下分別對受試者進行糖脂代謝指標測試。主要包括空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、口服75 g葡萄糖后2 h血糖 (2 hours postprandial blood glucose,P2hBG)、空腹胰島素(fasting insulin,FINS)、糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin,GHb)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)。

1.2.2 運動處方

采用功率自行車遞增負荷運動法測定受試者心臟功能能力(functional capacity,F.C.)，作為制定運動強度的依據。運動強度設定：1～4周40%～50%F.C.，5～12周50%～65%F.C.。運動方式為健步走，每次40～50 min，每周3～5次，持續3個月。

在運動干預過程中，通過舉辦專家講座、發放學習資料等方式，強化受試者運動干預相關知識。通過短信、電話、現場跟蹤等方式，指導受試者用心率表、計步器，結合脈搏、主觀體力感覺等控制運動強度和運動量。

1.2.3 基因多態性分析

采用SPSS 22.0統計學軟件分析研究所得數據。計量資料采用（±s）表示，計數資料采用（%）表示，分別以t檢驗與χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

選取KCNQ1基因區的7個標簽SNP位點rs2299620、 rs231362、 rs2237892、 rs2237895、rs2237897、rs151290、rs2283228。所選位點在基因組中的基本情況見表1。

從靜脈血白細胞提取基因組DNA。采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)對篩選的SNP進行分型。PCR引物和單堿基延伸引物用Assay Designer(Sequenom)軟件設計，由MassARRAYTyper軟件系統完成SNP位點基因型分析。

1.3 統計學分析

采用χ2檢驗分析各位點基因型分布是否符合哈溫平衡。單個位點不同基因型之間干預敏感性的差異以指標干預前初始值作為協變量進行協方差分析，顯著性水平α=0.05。

Shesis在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/myanalysis.php)計算同一基因不同位點間的D'和r2，以測量對應位點間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium,LD)緊密程度，并計算單體型頻率。多個位點的單體型分析采用R-平臺下haplo.stats的haplo.score軟件。以指標干預前初始值為協變量，以干預前后差值(Δ)表示各指標的干預敏感性，分析不同單體型的干預敏感性差異。顯著性水平α=0.05。

2 結果

各位點基因型分布均符合哈溫平衡(P＞0.05)。rs2237892、rs2237897位點中TT基因型僅2例，屬極低基因型頻率，根據相近合并的原則，將其與CT基因型合并統計。

2.1 單個位點多態性與糖脂代謝的關系

rs2299620位點TT基因型P2hBG最低(P＜0.05)。見表2。其余位點不同基因型在有氧運動干預前后指標無顯著性差異(數據略)。

表1 所選位點基本情況

表2 rs2299620位點不同基因型運動干預前后指標比較

2.2 單體型與糖脂代謝的關系

7個多態位點D'和r2見表3。對D'＞0.33且r2＞0.1的位點，組合成可能的單體型，計算單體型頻率，頻率＜0.03的單體型被忽略，進行單體型分析。結果顯示，rs2237897-rs2299620位點的單體型中，T-C單體型攜帶者ΔFINS高于非T-C單體型攜帶者；C-T單體型攜帶者ΔP2hBG高于非C-T單體型攜帶者。由rs2283228-rs2237892位點組成的單體型中，A-C單體型攜帶者ΔLDL高于非A-C單體型攜帶者。由rs2299620-rs151290位點組成的單體型中，T-C單體型攜帶者ΔP2hBG高于非T-A單體型攜帶者；rs2299620-rs2237892位點組成的單體型中，T-T單體型攜帶者ΔP2hBG高于非T-T單體型攜帶者。見表4。其余不同位點組成的單體型在運動干預前后糖脂代謝指標均無顯著性差異(數據略)。

3 討論

表3 KCNQ1基因7個多態位點兩兩間D'/r2

表4 KCNQ1基因部分位點單體型干預前后糖脂代謝指標差值比較

Hu等[7]在包括1769例T2DM和1734例血糖正常者的中國漢族人群中進行研究，在KCNQ1基因中發現 4個 SNP 位點 rs2074196、rs2237892、rs2237895、rs2237897與糖尿病發病相關。陳建豐等[8]、劉英等[9]的研究也證實rs2237892位點與T2DM發病相關。

日本Unoki等[10]對207,097例日本人的SNP進行篩查，證實KCNQ1是T2DM的重要侯選基因，且rs2283228、rs2237895、rs2237897是其中3個與T2DM發病密切相關的位點。KCNQ1基因多態性與T2DM發病的相關性也在其他人群中得到驗證[5-6,11-12]。

對特定人群使用相同運動處方干預時，效果存在明顯個體差異。如白細胞介素-6基因G174C多態與訓練對空腹血糖和葡萄糖耐量的影響相關[13]；維生素D受體基因BsmI多態與低體力活動對空腹血糖的影響水平之間存在關聯[14]。推測是由于不同基因多態對糖調節影響所致。Lakka等[15]的研究顯示，瘦素基因A19G和瘦素受體基因K109R多態決定了運動調節葡萄糖動態平衡的個體差異；過氧化物酶增殖體活化受體-γ基因Pro12Ala多態對高加索人、日本人運動干預敏感性均存在相關性[16-17]；Sakane等[18]對61例T2DM患者運動干預12周后發現，腎上腺素受體Ⅲ基因Trp64Arg多態與患者胰島素抵抗的運動干預敏感性相關。國內研究基因多態性與糖尿病發生及其并發癥發展之間關系較多[19-20]，而少見其與運動干預敏感性之間關系的研究。

本研究選取的7個位點均為標簽SNP，具有較好的代表性。經HaploView軟件分析，rs231362、rs2237892、rs2237895、rs2237897、rs2283228等5個多態位點有中度連鎖不平衡。一項以亞洲人群為研究對象的系統綜述，包括30個公開發表的病例對照實驗，114,140例患者和167,322例對照，表明這5個多態位點是糖尿病發生的危險因子[4]。另有多項研究證實，rs2237892與糖尿病的發生相關[21-23]。本研究顯示，rs2299620位點TT基因型，P2hBG運動后下降。與非單體型攜帶者相比，rs2237897-rs2299620的T-C單體型與ΔFINS相關聯，rs2237897-rs2299620位點的C-T單體型、rs2299620-rs2237892位點的T-T單體型、rs2299620-rs151290位點組成的T-A單體型均與ΔP2hBG相關聯，rs2283228-rs2237892位點的A-C單體型與ΔLDL相關聯。

運動改變胰島素敏感性，是運動改善糖脂代謝的主要途徑。在鉀離子通道蛋白的調節下，胰島β細胞KCNQ1蛋白表達增多，從而減少胰島素分泌，使血糖水平改變[24]，這可能是鉀離子通道蛋白參與糖尿病的部分機制。KCNQ1基因多態影響運動干預胰島素敏感性的具體機制尚不清楚，可能通過影響信號通路蛋白結合活性，進而影響目的基因的表達[25]。本研究揭示的相關基因多態位點的生物學活性還有待進一步深入研究，為有效防治糖尿病的發生發展提供可靠的實驗依據。

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