慶大霉素通過調節大鼠慢性炎癥控制高脂飲食對高血壓的影響*

歐陽輝 劉濤 朱興春

(1.西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 646000；2.南充市中心醫院心內科，四川 南充 637000；3.川北醫學院基礎醫學院病原生物學與免疫學實驗教學中心，四川 南充 637000；4.南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院組織工程與干細胞研究所，四川 南充 637000)

高血壓是全球最常見的心血管系統疾病之一[1]。早期國外研究報道：高脂飲食與高血壓發生密切相關，但未闡明其具體機制[2]。研究證實：慶大霉素灌胃干預能降低血中內毒素水平[3]，而高脂喂食則認為是內毒素升高的啟動因素之一，內毒素可引起機體低度炎癥[4-5]，而炎癥系統在高血壓發生發展的病理機制中扮演著重要的角色[6-7]。故本研究模擬機體通過高脂飲食導致血壓升高的病理環境、以及硫酸慶大霉素灌胃干預后血壓水平的變化、探索內毒素和炎癥因子在其中的作用，旨在尋找高脂喂食所致血壓升高的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗設備 多通道鼠尾動脈無創血壓儀BP6A；酶標儀；離心機；恒溫水浴箱實驗試劑IL-1βELISA試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司，胰島素ELISA試劑盒購自美國CLOUD-CLONE CORP公司；內毒素檢測試劑盒購自廈門鱟試劑實驗廠有限公司；硫酸慶大霉素購自四川省長征藥業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物與分組 清潔級健康雄性SD大鼠37只，8周齡，體質量160～200g，來自川北醫學院實驗動物中心(動物合格證號：SYXK(川)2013-076)。大鼠每3只或4只一籠，飼養于川北醫學院實驗動物中心，室內晝夜溫度(26±2℃)濕度50%左右，自由進食飲水，12h明暗周期。適應性喂養1周后隨機分為三組，對照組(11只)、高脂組(13只)、慶大霉素組(13只)。給予對照組標準飼料喂食；給予高脂組及慶大霉素組高脂飼料喂食，各飼料成分和能量供給(見表1)。第5周開始每周采用無創尾動脈測血壓法監測大鼠血壓，第9周開始慶大霉素組按照硫酸慶大霉素7.2mg/(kg d)[3]的標準給予灌胃干預，高脂組及對照組給予等體積生理鹽水灌胃。第13周末處死大鼠，收集標本。

1.2.2 無創血壓監測 實驗大鼠適應性喂養1周后，測得的血壓值作為基線水平。每周對大鼠進行束縛實驗訓練，減小后續血壓監測實驗中應激反應對血壓的干擾。第5周開始，應用BP6A動脈無創血壓儀尾套法測量尾動脈血壓。將清醒大鼠放入配套的大鼠籠，每次將3只大鼠放入無創血壓保溫箱中，溫度調至37℃底板開始加熱，點擊自檢按鈕，排除漏氣后可使用。依次將阻斷器、傳感器套于大鼠距尾根部較近處，當電腦顯示屏中基線出現穩定均勻的鋸齒脈搏波時，說明此時探測到大鼠脈搏且大鼠處于安靜狀態，給大鼠尾部阻斷氣囊充氣加壓，當阻斷器開始放氣減壓至脈搏波剛開始出現時記錄為收縮壓，繼續減壓會出現一個波峰，在波峰處則記錄為舒張壓，再繼續減壓隨及可出現大鼠平均動脈壓。記錄血壓的變化規律每只大鼠連續測定3～5次，取其大鼠安靜狀態下的血壓值，每周測1次。

表1 大鼠飼料成份表Table 1 Feed ingredients in rats

1.2.3 標本收集 藥物干預至第13周結束，2.5%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射。大鼠固定、皮膚消毒完畢，依次剖開腹、胸腔，用去熱源注射器右心室采血4ml注入去熱源肝素采血管；同樣方法采集4ml血至普通肝素采血管，30min內置于冰盒內，1000×g離心15min，取上清液置于﹣80℃保存。

1.2.4 血漿內毒素、IL-1β測定 血漿內毒素采用終點顯色法測定；炎癥因子IL-1β采用ELISA法檢測，所有操作步驟均按說明書進行。

1.2.5 血糖、胰島素及胰島素抵抗檢測 采用自動生化分析儀測定空腹血糖濃度；空腹胰島素采用ELISA試劑盒測定。計算穩態模型評估胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment insulin resistenceindex,HOMA-IR)，方法：HOMA-Ir=空腹血糖×空腹胰島素/22.5 。

2 結果

2.1 大鼠一般情況、體質量變化及生存分析 對不同組大鼠各個時間點(各次重復測量)行體質量監測，重復測量方差分析結果示：Mauchly的球形對稱檢驗結果認為數據不滿足球對稱條件(P<0.05)，結果需校正，Greenhouse-Geisser主體內效應的檢驗，不同時間點大鼠體質量差異有統計學意義(F=263.28，P<0.05)；時間與干預方法的交互作用差異有統計學意義(F=1.848，P<0.05)；不同干預組間效應檢驗，F=2.668，P>0.05，差異無統計學意義，可以認為3組不同的干預方法對大鼠體質量影響無差異。體質量變化趨勢(見圖1)。高脂組大鼠行動遲緩，毛發無光澤，呼吸急促；慶大霉素組大鼠死亡3只，死亡后立即解剖大鼠可見肺部嚴重感染灶，切面可見大量膿性分泌物(見圖2)，大鼠可能死于嚴重感染。高脂喂食組由于灌胃時操作不當窒息死亡1只。共死亡4只大鼠，死亡率為10.8%。

圖1 大鼠體質量變化趨勢圖Figure 1 Trend of body mass change in rats

注：三組不同的干預方法對大鼠體質量影響差異無統計學意義P>0.05

圖2 慶大霉素組死亡大鼠尸體解剖均為肺部感染Figure 2 Abdominal infection of the deod rats in gentamicin group

2.2 大鼠血壓變化 對三組大鼠每周行收縮壓監測，重復測量方差分析結果示：Mauchly的球形對稱檢驗滿足對稱條件(P=0.736>0.05)；主體內效應的檢驗，F=6.223，P<0.05；時間與干預方法的交互作用F=13.738，P<0.05；不同干預組間效應檢驗F=189.61，P<0.05，可以認為3組不同的干預方法對收縮壓影響有差異。第1周，3組大鼠收縮壓的基線值水平一致(P>0.05)。第5周時，高脂組和慶大霉素組大鼠的收縮壓顯著高于基線水平且高于對照組(P<0.05)，而對照組大鼠收縮壓較基線水平變化不明顯(P>0.05)。隨著喂養時間延長，高脂組和慶大霉素組大鼠收縮壓逐漸升高，而對照組大鼠收縮壓無明顯變化。第5～8周，高脂組和慶大霉素組收縮壓均明顯高于對照組(P<0.05)，高脂組和慶大霉素組收縮壓(P>0.05)。第9周灌胃干預后，慶大霉素組大鼠收縮壓逐漸下降，從第11周至第13周結束，慶大霉素組的收縮壓與對照組比較(P>0.05)，但從第10周至第13周顯著低于高脂組大鼠收縮壓(P<0.05)。從實驗初始至結束，對照組收縮壓變化不明顯。從第10周至第13周，將每周測得結果進行三組間比較，高脂組收縮壓水平均顯著高于對照組和慶大霉素(P<0.05)。大鼠收縮壓變化趨勢，見表2。

表2 三組大鼠收縮壓水平Table 2 The level of systolic pressure in three groups of rats

注：第10～13周為灌胃干預期。與對照組比較①P<0.05，②P>0.05，與高脂組比較③P<0.05，④P>0.05。

2.3 大鼠血漿內毒素及IL-1β測定 硫酸慶大霉素組內毒素水平(0.009±0.002EU/ml)高于對照組(0.006±0.001EU/ml)(P<0.05)、低于高脂組(0.012±0.002EU/ml)(P<0.05)；高脂組內毒素水平高于對照組(P<0.05)。對照組血漿IL-1β濃度(90.90±26.67ng/ml)和慶大霉素組血漿IL-1β濃度(106.6±34.84ng/ml)差異無統計學意義(P>0.05)，但均低于高脂組(265.63±71.53ng/ml)，且差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3，圖4。

圖3 三組大鼠內毒素濃度比較Figure 3 Comparison of endotoxin in the three groups

圖4 三組大鼠IL-1β水平比較Figure 4 Comparison of IL-1β in three groups of rats

2.4 三組大鼠血漿生化指標的測定比較，見表3。

2.5 大鼠空腹血漿葡萄糖、胰島素測定，穩態模型評估胰島素抵抗指數 各項指標，見表4。

表3 三組大鼠生化指標比較Tabre 3 Comparison of biochemical indexes in three groups of rats

注：LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇。與對照組和高脂組比較①P<0.05；與對照組及慶大霉素組比較②P<0.05。

Table4Fastingplasmaglucose,insulinconcentrationandinsulinresistanceinrats

組別n空腹血糖(mmol/L)空腹胰島素(Pg/ml)HOMA-IR對照組118.36±0.909.52±2.233.50±0.73高脂組127.07±1.0911.87±2.1①3.44±1.61慶大霉素組108.69±0.84②4.59±0.75②1.77±0.33②

注：HOMA-IR：穩態模型評估胰島素抵抗指數。與對照組和慶大霉素組比較①P<0.05；與對照組和高脂組比較②<0.05。

3 討論

研究發現，高脂喂食可致循環系統內毒素水平不斷增加，內毒素是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，可激活TOLL樣受體4(TLR4)信號通路和促炎因子產生，導致低度炎癥[8]。已有研究報道TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子能通直接作用于血管內皮細胞、促進血管平滑肌增殖、血管阻力增加從而引起高血壓[9-10]，結合本實驗發現：高脂喂食較普通喂食大鼠其血漿內毒素濃度、IL-1β顯著升高，且從高脂喂食第5周至實驗結束其收縮壓一直顯著高于對照組，證實了高脂喂食可通過升高血漿內毒素濃度而促進低度炎癥引起大鼠收縮壓升高。亦有研究發現，不僅激活的TLR4信號通路與胰島素抵抗密切相關[11]，而且TNF-α可與胰島素受體結合使其失活，白細胞介素均可作為炎癥因子與胰島素抵抗密切相關，IL-18與IL-1β等炎癥因子是導致胰島素耐受性的主要原因，但具體的分子機制至今不清楚[12-15]，同時大量證據提示高血壓與胰島素抵抗密切相關[16]。結合本實驗發現：慶大霉素組大鼠較高脂組其血漿內毒素濃度、IL-1β顯著降低，但反應急性炎癥的C反應蛋白各組間差異無統計學意義，胰島素抵抗明顯下降，且從第10周至實驗結束其收縮壓較高脂組明顯下降，最終趨于對照組水平，故在排除急性炎癥反應對大鼠血壓等指標干預的同時，有力的證實了慶大霉素灌胃干預可降低升高的血漿內毒素濃度而降低低度炎癥及胰島素抵抗，以致讓高脂喂食所致血壓升高得以控制。

研究證實，慶大霉素抗菌譜廣且以革蘭陰性菌為主能廣泛抑制腸道菌群、代謝周期快且不被腸道吸收，能減少對機體的影響[17]，研究證實[3]:慶大霉素灌胃可降低血漿內毒素濃度，和腸道細菌數量，在本實驗中硫酸慶大霉素組內毒素水平高于對照組、低于高脂組，而慶大霉素組炎癥因子水平與對照組一致且低于高脂組。既往研究發現細菌常在死亡、自溶、繁殖或者黏附在其他細胞時，才會釋放內毒素從而表現出毒性[18]。結合本實驗結果，可能是由于硫酸慶大霉素導致革蘭陰性菌大量死亡，以至內毒素釋放入血液，表現為該組內毒素水平高于對照組。雖然內毒素水平并未降低到和對照組水平一致，但該組血壓卻降低到了和對照組一致的水平，這說明機體內毒素濃度可能只有超過一定限度時才能引起機體炎癥因子升高從而引起血壓升高，將內毒素濃度控制在一定范圍，并不需要降低到正常值也能起到降壓作用。

大量研究已經發現高脂喂食可使大鼠收縮壓及舒張壓顯著升高，并提出可用高脂喂食建立大鼠非遺傳性高血壓模型的觀點[19-21]。隨著研究的深入，我們對高脂喂食和高血壓、內毒素、低度炎癥及胰島素抵抗的關系有了更深的了解。但高血壓與上述四者之間的關系極其復雜，如高脂喂食后機體發生了哪些具體的變化才會引起高內毒素血癥，繼而促發低度炎癥反應引起血壓升高，這些問題都有待進一步深入研究。

在本實驗過程中不容忽視的是，硫酸慶大霉素組有3只大鼠死亡，尸體解剖均發現肺部有嚴重的化膿感染灶，雖然硫酸慶大霉素可通過抑制腸道革蘭陰性菌從而減少內毒素，但長期使用亦可致二重感染。最新研究也發現抗生素不僅能損傷腸道菌群以削弱腸道的免疫功能，而且還能殺死腸道上皮細胞、對線粒體的功能造成顯著改變[22]。所以通過進一步優化給藥方式以期改善二重感染，或者利用其它手段減少機體內毒素含量有望成為干預高血壓等代謝性疾病的新的重要靶點。另一方面，本實驗沒有設立對照+慶大霉素組以排除慶大霉素對正常個體的影響。血壓監測方面：用大鼠無創動脈血壓監測儀來測量大鼠的收縮壓比較準確，但舒張壓往往測量不準，與文獻[6]血壓結果一致。實驗過程中大鼠心率是根據血壓波動圖相鄰兩波形之間的距離計算，但受到不同大鼠測得的波形大小不一，對心率的統計便會受到波形大小的影響，故大鼠心率測定不準確。體重測量方面：雖然實驗[6,23]均用“高脂喂食”干預但兩實驗一個采用高甘油三脂干預，另一個采用高膽固醇飼料干預，而本實驗飼料配方采用高甘油三脂，故能解釋為何大鼠體重和文獻[23]結果一致，與文獻[6]研究結果差異較大，結合既往研究[23]和本實驗研究結果可以得出：高脂飼料喂養法建立的動物模型適合應用于建立單純性高膽固醇血癥；高脂鼠和肥胖鼠在本質上還是有區別[23]。

4 結論

本研究結果提示，長期高脂喂食大鼠可誘發機體膽固醇升高[23]、慢性炎癥[4-5]和慢性炎癥所致的胰島素抵抗[12-15]而機體慢性炎癥和胰島素抵抗可致大鼠血壓升高[9-10,16]慶大霉素可通過降低機體慢性炎癥[3]、胰島素抵抗以控制高脂喂食所致的大鼠高血壓。

【參考文獻】

[1]ESH/ESC Task Force for the Management of Arterial Hypertension. 2013 Practice guidelines for the management of arterial hypertension of the European Society of Hypertension (ESH) and the European Society of Cardiology (ESC): ESH/ESC Task Force for the Management of Arterial Hypertension[J]. Blood Pressure, 2013, 31(10):1925-1938.

[2]Wilde D W, Massey K D, Walker G K,etal. High-fat diet elevates blood pressure and cerebrovascular muscle Ca2+ current[J]. Hypertension, 2000, 35(3):832-837.

[3]陳利江,權正學,謝春燕.慶大霉素對截癱大鼠腸道細菌移位影響的實驗研究[J].西部醫學,2009,21(4):547-549.

[4]Blasco-Baque V, Serino M, Vergnes J N,etal. High-fat diet induces periodontitis in mice through lipopolysaccharides (LPS) receptor signaling: protective action of estrogens[J]. PLoS One, 2012, 7(11):48220

[5]G?bele E, Dostert K, Hofmann C,etal. DSS induced colitis increases portal LPS levels and enhances hepatic inflammation and fibrogenesis in experimental NASH[J]. Journal of Hepatology, 2011, 55(6):1391-9.

[6]阮承超,高平進.免疫與炎癥參與高血壓發生發展的機制探討[J].中華高血壓雜志,2017,25(4):319-321.

[7]劉時彥,黃為民,張潤慧,等.鹽敏感性高血壓大鼠炎癥因子和內皮損傷因子的表達[J].中國動脈粥樣硬化雜志,2015,23(8):179-183.

[8]Bleau C, Karelis A D, St‐Pierre D H,etal. Crosstalk between intestinal microbiota, adipose tissue and skeletal muscle as an early event in systemic low‐grade inflammation and the development of obesity and diabetes[J]. Diabetes/metabolism Research & Reviews, 2015, 31(6):545-561.

[9]Zhang H, Park Y, Wu J,etal. Role of TNF-α in vascular dysfunction[J]. Clinical Science, 2009, 116(3):219-230.

[10] 薛冰,丁東新,顧平生,等.老年高血壓患者血清 TNF-α,IL-6的變化及其臨床意義[J].放射免疫學雜志,2004,17(4)：270-271.

[11] Dasu M R, Jialal I. Free fatty acids in the presence of high glucose amplify monocyte inflammation via Toll-like receptors[J]. American Journal of Physiology Endocrinology & Metabolism, 2010, 300(1):145-154.

[12] Defronzo R A. Insulin resistance: a multifaceted syndrome responsible for NIDDM, obesity, hypertension, dyslipidaemia and atherosclerosis[J]. Netherlands Journal of Medicine, 1997, 50(5):191-197.

[13] 李金梁,楊兆穎,伍海安,等.長期服用比索洛爾對于原發性高血壓患者糖脂代謝的影響[J].中國醫藥指南,2011,09(15)：288-290.

[14] Ohshima K, Mogi M, Jing F,etal. Roles of interleukin 17 in angiotensin II type 1 receptor-mediated insulin resistance[J]. Hypertension, 2012, 59(2):493-499.

[15] Zhang Y, Li Q, Rao E,etal. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet[J]. Immunity, 2015, 42(5):953-964.

[16] 李凡,薛建紅,英明中.高血壓與胰島素抵抗相關性機制的研究進展[J].中華老年心腦血管病雜志,2012,14(2):209-210.

[17] Skopnik H, Wallraf R, Nies B,etal. Pharmacokinetics and antibacterial activity of daily gentamicin[J]. Archives of Disease in Childhood, 1992, 67(1):57-61.

[18] 張虞婷,丁蘇蘇，李倚云，等.細菌內毒素的研究進展及其檢查法的應用[C].中國藥學大會暨中國藥師周，2014，27(5)：66-69.

[19] 黃輝,陳潔,王彤,等.20-HETE下調在高脂飲食所致高血壓機制研究[J].中國臨床實用醫學,2008,2(5):1-3.

[20] 田亞強,白潔,邱娟,等.長期高脂飲食對SD大鼠收縮壓的影響及機制[J].山東醫藥,2011,51(11):44-46.

[21] 王亞萍,宋艷,李昊,等.高脂喂食誘導的肥胖大鼠腎周脂肪與血壓的關系及替米沙坦干預的影響[J].中華高血壓雜志,2015(2).138-145.

[22] Morgun A, Dzutsev A, Dong X,etal. Uncovering effects of antibiotics on the host and microbiota using transkingdom gene networks.[J]. Gut, 2015, 64(11):1732-1743.

[23] 劉艦杭,歐陽軍.高脂飼料對大鼠血脂、體重的影響[J].中國現代醫生,2009, 47(14):23-24.