miR-135a與前列腺癌細胞增殖相關因子信號轉導及轉錄激活因子6的相關性研究

趙宇明,張 悅,王 華,田 寶,郭冬梅

(河北省秦皇島市第一醫院 066000)

前列腺癌是一種常見的泌尿系統惡性腫瘤，多發于老年患者，且病死率較高，是目前導致男性癌癥病死的主要原因之一[1-2]。隨著我國老齡化的不斷加重，前列腺癌患者的發病率也持續增高，給家庭和社會帶來了沉重的負擔，如何控制癌細胞的轉移和擴散并提高腫瘤治療的效果，對改善患者的預后具有重要的臨床意義[3-4]。多項研究表明，微小RNA(miRNA)可能在基因表達調控領域起重要作用，而多種miRNA 均參與腫瘤的發生、發展和轉移過程[5-6]。為了進一步探討miR-135a與前列腺癌細胞增殖相關因子信號轉導及轉錄激活因子(STAT6)的相關性，現對前列腺癌DU145細胞分別轉染miR-135a序列和空白序列后的細胞增殖情況、細胞周期、遷移和侵襲能力，以及p-STAT6和STAT6蛋白表達、miR-135a表達水平進行檢測分析，為臨床提供一定的治療理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 人激素非依賴前列腺癌細胞株DUl45購自中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心。

1.2儀器與試劑 (1)HR22型高速冷凍離心機(日本日立)，FS-7900型PCR儀 (美國應用生物系統公司)， Gel Doc 1000UV型分子定量成像系統(美國BIO-RAD公司)， Napco-541型二氧化碳培養箱(美國)，IX70型倒置相差顯微鏡(日本奧林巴斯)，880型酶標儀(德國拜發)。(2)胎牛血清、DMEM培養基、F12K-DMEM培養基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購自美國Gibco公司；Mature miRNA-135a和miRNA Negative Control(NC)均購自上海吉瑪公司； Trizol提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自美國Epitomics公司；脂質體(Lipofectamine)2000 購自Invitrogen 公司。CCK-8 試劑盒購自碧云天試劑公司；侵襲(Transwell) 小室購自美國Coring 公司；鼠抗人STAT6、p-STAT6 1抗和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、抗鼠2抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Bio Sharp公司。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養 DU145細胞株采用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素雙抗的F12K-DMEM培養基,在5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中進行培養，待細胞密度約80%時進行傳代培養,取指數生長期細胞進行實驗。

1.3.2細胞轉染 采用脂質體瞬時轉染法進行轉染：取對數期生長的細胞株接種于6孔培養板中，加入含10%胎牛血清的RMPI 1640完全培養基進行培養，待貼壁細胞生長至60%～70%融合后利用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染has-miR135a序列(miR-135a轉染組)及NC序列(空白轉染組)，轉染終濃度為50 mmol/L，嚴格按照說明書進行操作，轉染結束后加培養基增殖培養48 h。

1.3.3MTT檢測細胞增殖 分別于轉染48 h后取各組細胞懸液利用胰蛋白酶進行消化，加入含10%胎牛血清的RMPI 1640完全培養基進行培養，并于培養0、24、48 h時取各組細胞懸液加入MTT (5 mg/mL)孵育4 h，隨后加入DMSO進行溶解并沉淀，使用酶標儀在490 nm波長測定各孔的吸光值(A)，觀察各組細胞增殖情況，每組實驗重復3次。

1.3.4流式細胞儀檢測細胞周期 分別于轉染48 h后取各組細胞懸液，應用胰蛋白酶進行消化，1 000 r/min離心15 min后收集細胞沉淀，以PBS洗滌2次加入預冷75%乙醇在―20 ℃條件下固定24 h，1 000 r/min離心15 min棄上清液，最后加入500 μL細胞周期固定液重懸細胞，4 ℃避光孵育30 min，使用流式細胞儀測定細胞周期。

1.3.5Transwell細胞遷移侵襲實驗 先以無血清培養基37 ℃潤濕Transwell小室2 h，將轉染48 h的各組細胞采用胰酶消化后計數，選取1×106個細胞以無血清的RPMI 1640培養液進行重懸并接種于上室，下室中僅加入10%的完全培養基，37 ℃、5% CO2培養48 h。取出濾膜后以10%多聚甲醛固定，蘇木紅染色在光鏡下觀察，計數穿膜細胞數，取其均值代表遷移力量值。

1.3.6蛋白免疫印跡法(Western blot)實驗 取轉染后培養48 h的各組細胞，洗去培養基后提取總蛋白，并取約75 μg以10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離后轉移至孔徑為0.45 μm的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，置于5%脫脂奶粉中封閉2 h；加入STAT6和p-STAT6 1抗后4 ℃孵育過夜，0.5%TBS-T溶液洗膜3次后再加入LRH標記的2抗進行反應，0.5%TBS-T溶液洗膜3次，使用化學發光法進行顯色，并采用軟件進行灰度值分析，計算各目標蛋白與β-actin的灰度比值。

1.3.7RT-PCR實驗 取各組轉染后培養48 h的細胞，采用Trizol提取試劑盒提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒逆轉錄為DNA，在聚合酶作用下進行擴增，擴增引物為上游：5′-CCG ACG CGT TCT TTT CTG TTG CCC CAT C-3′；下游：5′-CCC AAG CTT GGA CCG CAG CAC CTA TCT-3′。擴增條件：95 ℃ 5 min后以95 ℃15 s 變性、60 ℃、60 s 退火、72 ℃ 5 min 30 s延伸，此為1個循環，共40個循環，電泳后進行RT-CPR測定，獲得miR-135a的表達水平。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結 果

2.12組轉染DU145細胞的miR-135a表達結果比較 轉染后48 h，miR-135a轉染組miR-135a相對表達量為(0.932±0.061)，明顯高于空白轉染組(0.023±0.002)(t=36.482，P<0.05)。

2.22組miR-135a對DU145細胞的增殖能力結果比較 miR-135a轉染組培養24、48 h的OD值分別為(0.210±0.045)、(0.281±0.052)，明顯低于空白轉染組(P<0.05)。見表1。

表1 2組DU145細胞不同時間點OD值結果比較

2.32組miR-135a對DU145細胞周期影響的結果比較 miR-135a轉染組G0/G1期細胞比例為(60.02±6.39)%，明顯高于空白轉染組(45.34±7.22)%(t=3.730，P<0.05)。

表2 2組DU145細胞遷移和侵襲的結果比較

圖1 Transwell細胞遷移和侵襲圖

2.42組miR-135a對DU145細胞遷移和侵襲的結果比較 miR-135a轉染組遷移細胞數和侵襲細胞數分別為(116.93±30.02)個和(133.02±28.51)個，明顯低于空白轉染組(P<0.05)。見表2和圖1。

2.52組miR-135a對DU145細胞STAT6表達影響的結果比較 miR-135a轉染組p-STAT6和STAT6蛋白相對表達量分別為(0.947±0.114)和(0.437±0.077)，明顯低于空白轉染組[(1.320±0.104)和(0.783±0.095)](t=-5.757、-6.931，P<0.05)。見圖2。

注：1表示 miR-135a轉染組；2表示空白轉染組

圖2 Western blot檢測圖

3 討 論

前列腺癌是指發生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，包括腺癌、導管腺癌、尿路上皮癌、鱗狀細胞癌、腺鱗癌等，其中前列腺癌占95%以上[7-8]。隨我國老齡化人口的加重，前列腺癌的發病率也逐漸上升，其病死率較高，現已成為危害男性健康的首位腫瘤[9]。前列腺癌的具體發病原因和機制尚不完全清楚，一般認為與遺傳因素有關；且前列腺癌多侵襲膀胱、精囊、血管神經束等，并可通過盆腔淋巴結轉移引起雙下肢水腫，部分患者還會發生骨轉移，給臨床治療造成難度[10-11]。miRNA是一類重要的內源性單鏈非編碼小RNA分子，可調控細胞生物的發育、增殖、分化、代謝、凋亡、應激等過程，通過與靶mRNA的互補配對而在轉錄后水平上對基因表達進行負調控，導致mRNA的降解和翻譯抑制[12]。越來越多的研究表明，miRNA與腫瘤的發生、發展等過程密切相關，但目前對于miRNA在前列腺癌中的發病機制研究較少[13]。miR-135a是miR-135家族的重要成員之一，具有促進細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用，其在多種腫瘤的發生、發展中發揮了重要的調控作用。有研究報道，miR-135a促進細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用是通過對JAK2(Janus kinase 2)及相關通路(JA-STAT)的調控而實現，但具體機制仍需作進一步的研究[14]。

本研究結果表明，轉染48 h后miR-135a轉染組miR-135a相對表達量明顯高于空白轉染組(P<0.05)，提示miR-135a轉染組細胞miR-135a明顯高表達。通過MTT檢測細胞增長率發現，miR-135a轉染組培養24、48 h的OD值明顯低于空白轉染組(P<0.05)，提示miR-10a高表達可抑制腫瘤的增長。通過流式細胞儀測定細胞周期顯示，miR-135a轉染組G0/G1期細胞比例為明顯高于空白轉染組(P<0.05)，說明miR-135a可顯著地阻滯DU145細胞周期，進一步抑制腫瘤細胞的增長。侵襲實驗發現，miR-135a轉染組遷移細胞數和侵襲細胞數分別明顯低于空白轉染組(P<0.05)，提示miR-135a與前列腺癌細胞的侵襲和遷移高度相關，其高表達可抑制細胞的侵襲和遷移，但其具體機制仍需作進一步的深入研究。

STAT6是一種相對分子質量約為94×103的蛋白質，屬于STAT家族，可通過JAK-STAT信號轉導途徑介導多種細胞因子的活化，進而參與多種疾病的發生和發展。有研究報道，STAT6是miR-135a的潛在靶基因，可能與miR-135a抑制癌細胞增殖、遷移、侵襲等機制有關，與本研究的研究結果基本一致[15]。本研究結果表明，miR-135a轉染組p-STAT6和STAT6蛋白相對表達量均明顯低于空白轉染組(P<0.05)，說明miR-135a高表達可抑制前列腺癌細胞STAT6蛋白的表達，而這可能是miR-135a抑制前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的機制之一，但具體機制仍需作進一步的實驗。

綜上所述，miR-135a可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移、侵襲的能力，可能與其抑制前列腺癌細胞STAT6表達有關。

參考文獻

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