普通煙草PMEI家族的鑒定與表達分析

韓林賀， 丁安明， 孔英珍

(1.中國農業科學院煙草研究所/中國農業科學院煙草遺傳改良與生物技術重點開放實驗室，山東青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081)

果膠是存在于植物細胞胞間層以及初生細胞壁和次生細胞壁中一類成分復雜的多糖，是植物中一大類主要以半乳糖醛酸組成骨架結構的酸性多糖所形成的復合體的統稱，也是雙子葉植物和除玉米外的單子葉植物細胞壁的主要組成成分，約占細胞壁組成的30%～40%[1]。根據果膠多糖大分子的成分與構成的不同，主要可以分為以下3類：同聚半乳糖醛酸聚糖(homogalacturonan，簡稱HG)，Ⅰ型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan Ⅰ，簡稱RG Ⅰ)和Ⅱ型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(rhamnogalacturonan Ⅱ，簡稱RG Ⅱ)，這3類聚糖是果膠多糖組分的主要多糖[2-4]。細胞壁中的果膠對維持細胞壁穩定和抗壓能力有一定的作用，也是植物應對病原體侵害的重要屏障。果膠的甲酯化和去酯化能夠引起植物細胞壁結構和功能特性的改變，在果實成熟軟化、器官脫落和衰老[5-7]、花粉發育、花粉管生長[8-10]和抗逆性[11-12]等方面具有重要作用。果膠去甲酯化形成的果膠酸，會與胞外的Ca2+結合形成果膠酸鹽，使植物細胞壁硬化，導致植物細胞生長緩慢。同時，去甲酯化形成的甲醇和氫離子，會影響其他果膠水解酶的活性[13-14]。果膠去甲酯化的過程是由果膠甲酯酶(pectin methyl ester enzyme，簡稱PME)催化完成的，PME的活性同時又受果膠甲酯酶抑制劑(pectin methyl ester enzyme inhibitor，簡稱PMEI)的調控。Sénéchal等通過對PME17、PMEI4在擬南芥中的共表達分析和PMEI4突變體的特征分析，發現PMEI17和PMEI4相互作用；后來通過對體外PME/PMEI復合體生物化學特征進行詳細分析，發現在一定的pH值范圍內，PME3的酶活性直接受PMEI7調控[15-16]。PMEI廣泛存在于高等植物以及一些能降解植物細胞壁的微生物如細菌、真菌中[17]。目前人們僅對擬南芥、石松類以及桃、獼猴桃等高等植物的PMEI基因家族進行了相關結構分析和功能研究。Hothorn等于2004年獲得了擬南芥PMEI的三維結構，該結構由4條反向平行的α螺旋組成，分別為α1、α2、α3、α4，構成PMEI的活性區域；在氮末端區域有3條短的彎曲的α螺旋，分別為αa、αb、αc，維持PMEI結構的穩定性。PMEI蛋白序列中有4個極為保守的半胱氨酸，分別位于α2、α3、αa、αb上[18]。Di Matteo等根據已獲得的獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑氨基酸序列，人工合成其基因序列，在畢赤酵母中進行表達獲得純化的PMEI蛋白，將其與從番茄中提取的PME組合，獲得二者復合物的三維結構[19]。梅曉宏等發現，在新鮮果蔬汁中加入PMEI可以阻止果膠形成果膠酸鹽吸附果肉，防止果蔬汁變質[20]。根據Juge等的研究，PMEI成員參與果膠新陳代謝，影響谷類植物細胞壁多糖的形成[21-22]，從而影響韌皮纖維的伸長。相關研究表明，PMEI參與果實的形成過程，番茄中的SolyPMEI在果實的發育過程中特異表達[23]，葡萄中的VvPMEI1也參與果實的成熟過程[24]。用水楊酸(SA)處理辣椒6 h后，辣椒細胞內的PMEI含量顯著升高，表明PMEI與水楊酸信號調節有關[25-26]。在用雙氧水處理水稻幼苗 48 h 后，辣椒幼苗體內PMEI含量顯著升高，表明其與植物體抗氧化作用有關[27]。因此，對植物中PMEI的特性及生物學功能進行研究具有重要的理論和應用價值。

煙草是我國重要的經濟作物，同時也是進行生物學研究的重要模式植物，但是對煙草PMEI基因家族的研究鮮見報道。煙草的主要收獲器官是葉片，葉片細胞壁中的多糖聚合物不僅維持煙葉在生長發育過程中的形態，還影響煙葉的物理特性、加工特性以及煙葉的吸食質量。煙葉細胞壁中的果膠含量與煙葉平衡含水率、填充力、燃燒性呈正相關，與煙葉厚度、葉質重及香氣、余味、雜氣得分、評吸總分呈負相關[28-30]。因此，研究煙草PMEI家族基因對果膠甲酯化過程的調控作用及其對細胞壁結構的影響具有重要意義。本研究以普通煙草PMEI家族(NtPMEI)為研究對象，采用生物信息學手段對其基因家族各成員之間的進化關系及其基因結構、編碼蛋白的物理化學性質、保守結構域、亞細胞定位、基因本體(gene ontology，簡稱GO)分析、組織表達等進行研究，以期為研究煙草中PMEI家族的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

普通煙草品種紅花大金元(簡稱HD)，于溫室種植，自然條件下培養至成熟期。取幼苗期的根、莖、葉、葉脈和成熟期的根、莖、葉、葉脈及花芽，經處理后于液氮中速凍，-80 ℃保存備用。

1.2 NtPMEI家族序列鑒定與理化性質分析

基于Wang等報道的擬南芥71個PMEI家族成員的序列[31]，利用序列相似性分析，預測煙草基因組PMEI家族。從TAIR數據庫(http：//www.arabidopsis.org/)下載擬南芥PMEI家族蛋白全長序列，從Pfam數據庫(http：//pfam.xfam.org/)下載PMEI家族蛋白結構域序列(Pfam ID：PF04043)。將兩類序列在煙草基因組數據庫(http：//218.28.140.17/)和NCBI數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進行Blastp檢索(e值≤10-15)，獲得普通煙草的PMEI類似序列，人工去除冗余序列，作為NtPMEI家族的候選序列。結合Pfam數據庫[32]中PMEI結構域保守序列(序列號PF04043)和SMART在線分析軟件(http：//smart.embl-heidelberg.de/)[33]對候選序列進行PMEI結構域分析，剔除不含有該結構域的蛋白質序列，最終鑒定出90條NtPMEI家族蛋白序列。利用ExPASyProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)對所得煙草PMEI家族蛋白序列進行理化性質分析[34]。

1.3 NtPMEI蛋白序列保守域與進化分析

利用Muscle程序[35]對擬南芥和普通煙草PMEI家族的蛋白序列進行多序列比對，參數選為默認值。基于比對結果，利用MEGA6.0軟件[36]，采用鄰接法(neighbor-joining，簡稱NJ)構建擬南芥和普通煙草PMEI家族進化樹，Bootstrap檢驗參數設置為1 000。利用MEME4.11.2(Multiple Expectation Maximization for Motif Elicitation)[37]在線平臺(http：//meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)對90個NtPMEI家族蛋白進行保守基序分析，最大motif檢索值定為20。利用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW在線平臺(http：//www.genome.jp/tools/clustalw/)進行多序列比對，Output Format格式設置為FASTA格式。利用BoxShade Server在線平臺(http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)，將各蛋白保守區域進行可視化。選取結構域保守的蛋白序列為目標序列，在SWISS-MODEL網站(http：//swissmodel.expasy.org/interactive)上查找三維結構模板，根據覆蓋率、一致性百分比、試驗可靠性選擇最適的三維結構模板。

1.4 NtPMEI蛋白編碼基因的表達模式分析與驗證

為分析所預測的候選NtPMEI基因的表達模式，在煙草基因組數據庫(http：//218.28.140.17/)中下載煙草基因組組織表達數據，利用R語言Bioconductor程序對轉錄數據進行分析，使數據均一化，利用MeV本地軟件對結果進行可視化分析。選擇部分候選NtPMEI基因進行組織特異性表達驗證，使用TRANS Kit提取總RNA，參照說明書步驟，利用反轉錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit合成第一鏈cDNA，作為PCR擴增模板。以煙草管家基因actin(GenBank登錄號為EU938079.1)作為內參基因，反應體系：10 μL 2×FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)、0.6 μL正反向引物(10 μmol/L)、1 μL模板cDNA、7.8 μL ddH2O(RNase free)。在熒光定量PCR儀Applied Biosystem 7500(ABI7500)上進行qRT-PCR反應，程序如下：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共40個循環，加溶解曲線；每個樣品重復3次。用7500 software v2.0.1對結果進行分析，并對相對表達量進行作圖。

2 結果與分析

2.1 NtPMEI家族蛋白序列鑒定及進化分析

利用擬南芥PMEI家族71條蛋白全長序列和保守結構域序列，在煙草基因組數據庫和NCBI數據庫中進行Blastp比對，獲得105條煙草PMEI家族候選序列。結合Pfam數據庫中PMEI結構域保守序列(序列號PF04043)和SMART在線程序，對候選序列進行保守結構域分析，去除不含有PMEI結構域的序列，在普通煙草基因組中共鑒定出90條PMEI蛋白序列。根據煙草注釋信息中基因在染色體上的位置，對90個成員進行重新編號，以便后續研究(表1)。

將得到的90個NtPMEI家族成員全長蛋白序列與擬南芥PMEI家族71個成員進行系統發生分析(圖1)，根據擬南芥的分類方式將NtPMEI家族成員分為5個亞家族(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，各個亞家族分別含有17、6、2、8、57個NtPMEI成員(圖1、表1)。通過分析NtPMEI蛋白編碼基因結構發現，大多數基因不含有內含子。其中，第Ⅱ、Ⅲ亞家族成員均不含有內含子，第Ⅰ亞家族中的NtPMEI1、NtPMEI42分別含有6、5個內含子，第Ⅳ亞家族中有3個成員各含有1個內含子，第V亞家族中有1/2的成員含有內含子(表1)。

2.2 NtPMEI家族蛋白理化性質分析

對獲得的NtPMEI家族成員蛋白序列進行理化特征分析，表1結果顯示，NtPMEI蛋白序列平均長度在284個氨基酸左右，其中序列最長的NtPMEI37和最短的NtPMEI17都屬于第Ⅴ亞家族，分別由685、108個氨基酸殘基組成。不同亞家族之間的氨基酸序列長度變化呈現不同規律，第Ⅱ亞家族蛋白序列長度大多在200個氨基酸左右；第Ⅴ亞家族有30%以上成員的蛋白序列長度在500個氨基酸以上。NtPMEI家族成員蛋白分子量變化范圍在11.72～75.63ku之間，變化范圍較大。NtPMEI家族成員理論等電點變化范圍較大，介于 3.99～10.55 之間。第Ⅰ亞家族成員理論等電點大多介于 4.45～6.99，只有1個蛋白的理論等電點為8.64，說明該家族成員蛋白序列中多為酸性氨基酸；第Ⅲ亞家族的2個成員理論等電點均為4.26，在酸性范圍內，說明該亞家族成員蛋白序列中含有較多的酸性氨基酸。

表1 NtPMEI家族理化性質分析

續表1

基因名稱亞家族染色體定位氨基酸數量(個)分子量(ku)等電點內含子數量(個)亞細胞定位擬南芥同源基因煙草序列號NtPMEI30ⅤChr0520622.968.200CWAT4G25260Ntab0897290NtPMEI31ⅤChr0516418.049.520ChloAT1G62770Ntab0897310NtPMEI33ⅤChr0512814.035.160ChloAT2G01610Ntab0145490NtPMEI36ⅤChr0658363.947.231CWAT2G47030Ntab0936920NtPMEI37ⅤChr0668575.634.652ChloAT5G27870Ntab0977780NtPMEI38ⅤChr0620622.888.230CWAT4G25260Ntab0787520NtPMEI39ⅤChr0621724.119.770ChloAT1G62770Ntab0787510NtPMEI41ⅤChr0719721.659.340ChloAT5G20740Ntab0298990NtPMEI45ⅤChr0919721.608.130NuclAT4G25250Ntab0442870NtPMEI46ⅤChr1058765.056.871CWAT2G47030Ntab0968090NtPMEI47ⅤChr1122123.936.890ChloAT1G14890Ntab0448270NtPMEI48ⅤChr1120322.277.621ChloAT5G20740Ntab0496350NtPMEI49ⅤChr1255760.978.361VacuAT5G27870Ntab0719690NtPMEI54ⅤChr1418821.119.670ChloAT5G20740Ntab0820670NtPMEI56ⅤChr1654760.277.451ChloAT5G49180Ntab0751610NtPMEI59ⅤChr1757562.949.761NuclAT5G04960Ntab0042420NtPMEI60ⅤChr1757462.549.541NuclAT5G04960Ntab0042410NtPMEI62ⅤChr2021423.849.240ChloAT1G62770Ntab0415240NtPMEI63ⅤChr2021023.449.550CWAT1G62770Ntab0415270NtPMEI64ⅤChr2419521.489.140CWAT3G62820Ntab0948330NtPMEI68Ⅴscaffold_13121023.449.620CWAT1G62770Ntab0118820NtPMEI69Ⅴscaffold_13121323.809.250ChloAT1G62770Ntab0118870NtPMEI70Ⅴscaffold_15319421.719.850ChloAT5G20740Ntab0195860NtPMEI71Ⅴscaffold_27457363.346.941CWAT2G47030Ntab0485760NtPMEI72Ⅴscaffold_31757363.346.941CWAT2G47030Ntab0561510NtPMEI73Ⅴscaffold_34119520.9810.550ChloAT5G62350Ntab0595600NtPMEI75Ⅴscaffold_43422724.567.880ChloAT2G01610Ntab0684860NtPMEI77Ⅴscaffold_70919521.0110.020ChloAT5G62350Ntab0843700NtPMEI78Ⅴscaffold_72220623.337.590ChloAT1G14890Ntab0851410NtPMEI79Ⅴscaffold_74421123.129.510ChloAT1G62770Ntab0863320NtPMEI80Ⅴscaffold_80556462.437.701CWAT2G47030Ntab0894650NtPMEI81Ⅴscaffold_105955860.968.481VacuAT5G27870Ntab0025690NtPMEI82Ⅴscaffold_115419421.055.890ChloAT2G01610Ntab0063700NtPMEI83Ⅴscaffold_120257662.9010.092CytoAT5G04960Ntab0081000NtPMEI87Ⅴscaffold_211421022.959.480ChloAT1G62770Ntab0354790NtPMEI89Ⅴscaffold_262415216.649.350ChloAT3G62820Ntab0462850NtPMEI90Ⅴscaffold_399120622.968.220CWAT4G25260Ntab0658260

注：CW表示細胞壁，Nucl表示細胞核，Mito表示線粒體，Chlo表示葉綠體，Cyto表示細胞質，E.R.表示內質網，Vacu表示液泡，Plas表示質粒。

從上述分析結果可以看出，NtPMEI同一亞家族中蛋白成員及其編碼基因在結構和理化特征上均比較相似，從側面反映了系統發育分析的可靠性。

2.3 NtPMEI家族保守基序分析及PMEI結構域三維結構預測

利用MEME4.11.2在線程序對NtPMEI家族90個成員蛋白序列進行保守基序(motif)分析，以便進一步了解NtPMEI家族中蛋白氨基酸序列的保守性，共鑒定出8個保守基序(圖2)。

使用Pfam和SMART對每個保守基序進行注釋分析，發現有3個保守基序與PMEI結構域重合，分別為motif2、motif7、motif8。對擬南芥PMEI蛋白序列進行保守基序分析，同樣鑒定出PMEI結構域序列對應3個相同的保守基序，分別為motif2、motif7、motif8(圖3)，與煙草PMEI的保守基序相同，證明了對煙草序列進行保守基序分析結果的可靠性。與二級結構相比較，這3個保守基序分別對應PMEI的活性區域和氮末端螺旋區域。因此，推測煙草中moti2、moti7組成NtPMEI的活性區域，motif8維持NtPMEI結構的穩定性。

以第Ⅳ亞家族為例，將其成員NtPMEI15、NtPMEI58、NtPMEI65與擬南芥AtPMEI1進行多序列比對，發現煙草和擬南芥的PMEI結構域序列相似，都有4個極保守的半胱氨酸殘基(圖4-A)。選擇PMEI結構保守的NtPMEI65進行保守結構域的三維結構預測，與擬南芥PMEI的三維結構(圖4-B)進行比較，發現煙草的PMEI結構同樣由4條長的反向平行的α螺旋和3條短的α螺旋組成(圖4-C)。

2.4 NtPMEI家族的表達模式分析

從普通煙草高通量轉錄組測序數據庫中提取PMEI基因家族在煙草10個組織的表達量數據，包括播種后種子、葉脈、葉片(離體24 h)、愈傷組織、幼根、幼葉、成熟根、成熟葉、花芽、莖。對獲得的數據進行分析，利用R語言將數據進行可視化，繪制熱圖。

由圖5可以看出，有28個NtPMEI成員在所有組織中均沒有表達，其余62個成員分別在不同時期、不同組織中有所表達，約占整個亞家族的68.9%，表明大部分NtPMEI成員參與煙草的生長發育過程。其中有11個成員在所有組織中都有表達，但在不同組織中的表達量有明顯差異。進一步分析發現，不同亞家族成員在不同組織中的表達情況有較大差異，具有一定的組織特異性。第Ⅱ、Ⅲ亞家族成員在各組織中的表達量很低；第Ⅰ亞家族中有3個成員在所選取的10個組織中未有表達，其他成員在不同組織中均有表達，在幼根、花芽和莖中表達數較多；第Ⅳ亞家族成員在葉脈、莖中的表達量較高；第Ⅴ亞家族成員廣泛參與植物各階段的發育，其中在葉脈、幼葉、幼根和莖中的表達量較高。分析在幼根、成熟根中表達的基因發現，在幼根中表達量較高的基因在成熟根中絕大多數也有表達而且表達量相對較高，但相比在成熟根中的表達量較低。結果分析表明，NtPMEI基因家族在不同組織中的表達存在差異，這可能與基因的表達模式以及基因在組織中特異性表達和環境因素有關。

為驗證基因芯片數據分析的可靠性，本研究選取煙草8個不同時期的組織提取RNA并反轉為cDNA，進行5個NtPMEI基因在其中的表達量驗證。圖6顯示NtPMEI1、NtPMEI11、NtPMEI12、NtPMEI18和NtPMEI84在煙草(HD)幼苗期根、莖、葉、葉脈和成熟期根、莖、葉、葉脈及花芽中的表達情況。總體上看出，這5個基因在所選取的組織中均有表達，在不同組織中的表達量存在明顯差異，但表達趨勢和芯片數據大體一致。NtPMEI1、NtPMEI11和NtPMEI12 在花芽中的表達量相對較高，而NtPMEI1、NtPMEI11在成熟期的葉中幾乎不表達；NtPMEI12在幼苗期的莖和成熟期的葉中幾乎不表達，在幼苗期的葉脈中表達量也很低；NtPMEI18在成熟期的根、葉脈中表達量相對較高；NtPMEI84在幼苗期的葉中表達量相對較高。比較各基因在幼苗根、成熟根中的表達量發現，除NtPMEI12外，其他4個基因在成熟根中的表達量均呈下調趨勢。

3 討論

前人研究表明，PMEI家族在植物果實成熟軟化、器官脫落和衰老、花粉發育、花粉管生長和抗逆性等多個生長發育階段均發揮重要作用。煙草是分子生物學研究的模式植物，中國煙草基因組計劃的完成，為煙草基因組PMEI家族的鑒定和進一步的功能研究提供了便利。本研究采用生物信息學方法，從普通煙草基因組中鑒定出90條NtPMEI基因家族成員。系統發生分析結果表明，煙草PMEI家族分成5個亞家族，同一亞家族成員都能較好地聚為一類，并且相應的結構域類型與前人研究的基本一致。對基因中內含子和外顯子的組成進行分析，可為基因在進化分析研究中提供重要證據[38]。本研究對候選NtPMEI基因家族各成員的內含子數量進行分析發現，大多數NtPMEI基因家族各成員的基因結構中都不包含內含子，部分基因包含1～2個內含子，只有NtPMEI1、NtPMEI42分別含有6、5個內含子，表明NtPMEI基因家族各基因間保守性較高，該基因家族進化程度比較高。通過將煙草PMEI結構域保守序列與擬南芥PMEI序列作多序列比對分析，發現煙草PMEI序列中也含有4個極保守的半胱氨酸殘基，形成2個二硫鍵，維持PMEI的三維結構[39]。通過以第Ⅳ亞家族中的NtPMEI65為例作三維結構預測，發現煙草PMEI的三級結構和擬南芥極為相似。

組織表達分析發現，在不同組織中均有NtPMEI成員進行表達，說明該基因家族成員廣泛參與了煙草的生長發育過程。Wolf等的研究發現，AtPMEI1(AT1G48020)和AtPMEI2(AT3G17220)對促進花粉及花粉管的形成具有一定的作用[40-41]。在系統進化樹中，煙草中的NtPMEI3、NtPMEI19、NtPMEI50和NtPMEI53與AtPMEI1、AtPMEI2基因高度同源，推測這4個基因在煙草中也能夠影響花粉和花粉管的形成與發育。部分NtPMEI基因的驗證結果也同樣表明，所選取的5個NtPMEIs在普通煙草的花都中有表達，表明這幾個基因參與花的發育過程。相關研究表明，PMEI基因的敲除和過表達都會對擬南芥的生理特性產生影響。Peaucelle等通過對AtPMEI3轉基因株系進行研究，發現AtPMEI3過表達會引起分生組織中同聚半乳糖醛酸(HGA)高度甲酯化， 并且影響葉序的發育[42]。煙草中的NtPMEI41、NtPMEI48、NtPMEI54和NtPMEI70與AtPMEI3基因高度同源，推測這4個基因在煙草中過表達也會影響分生組織中HGA的甲酯化程度和葉序的發育。Müller等發現，AtPMEI5在擬南芥中過表達會引起不正常的發育形態，如發芽率升高、莖卷曲和器官融合[43-44]。通過系統發育分析發現，NtPMEI基因家族中NtPMEI14、NtPMEI34、NtPMEI35、NtPMEI61和NtPMEI65與AtPMEI5高度同源，推測這5個基因在煙草中過表達也會導致植株的不正常發育。An等發現，辣椒中的CaPMEI1(A5X5I9)基因與水楊酸(SA)信號調節有關，能夠響應逆境脅迫[26]。通過序列相似性比對分析，發現煙草中的NtPMEI4、NtPMEI22和NtPMEI23與A5X5I9基因高度同源，推測這3個基因在煙草中與抗非生物脅迫有關。Saez-Aguayo等研究發現，擬南芥種皮表皮細胞中的AtPMEI6(AT2G47670)通過抑制同聚半乳糖醛酸的甲酯化，從而提高種皮黏液質的分泌[45]，通過序列相似性比對分析發現，煙草中的NtPMEI64、NtPMEI89與AtPMEI6基因高度同源，推測這2個基因在煙草中可能行使相似的功能。

綜上，本研究對普通煙草基因組中的90個PMEI家族成員進行了進化分析、蛋白理化性質和功能域分析，確定了其在染色體上的位置，并通過分析芯片數據和熒光定量試驗驗證了部分成員的組織表達模式。通過本研究，對煙草PMEI家族成員有了初步了解，為今后PMEI家族成員的功能研究奠定了基礎。為了更好地了解煙草PMEI家族成員的結構和功能，下一步將對相關基因進行克隆、表達模式分析、功能驗證等，探索其在煙草生長發育中的作用。

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