茶樹CsLhcb4基因的電子克隆與生物信息學分析

梅菊芬， 徐德良， 湯茶琴， 周靜峰， 邵元海

(無錫市茶葉品種研究所/江蘇省茶樹種質改良與推廣工程技術中心，江蘇無錫 214125)

光合作用產物是人類賴以生存和發展的基礎，光捕獲是植物光合作用的重要過程。在高等植物中，捕光葉綠素a/b結合蛋白(light harvesting chlorophyll a/b binding protein，LHC)是光捕獲中的重要功能蛋白，其與葉綠素a/b形成復合體，將光能迅速傳到光系統Ⅰ(PSⅠ)和光系統Ⅱ(PSⅡ)的反應中心，使光能轉化為化學能，促進光合反應的進行[1]。PSⅠ和PSⅡ都含有各自的LHC，即LHCⅠ和LHCⅡ。其中，LHCⅡ在類囊體膜上的含量最為豐富，它所結合的葉綠素約占類囊體膜上色素量的50%，目前研究較多，也是結構較清楚的一類膜蛋白[1-3]。LHCⅡ被認為是一類結構相似、進化相關、由核基因家族(Lhcb)編碼的蛋白，與色素所形成的色素蛋白復合體家族，含有保守的葉綠素結合(chlorophyllbinding，CB)結構域，它們除進行光能的捕獲與傳遞外，還廣泛參與了激發能在PSⅠ和PSⅡ之間的調節與分配、類囊體膜結構的維持、光保護以及對各種環境的應答等[4]。LHCⅡ主要由6種色素蛋白復合體組成，分別由Lhcb1、Lhcb2、Lhcb3、Lhcb4、Lhcb5和Lhcb6編碼，其組成了4種蛋白亞復合物，LHCⅡa、LHCⅡb、LHCⅡc、LHCⅡd。其中，LHCⅡb為主體LHCⅡ，包括LHCB1、LHCB2、LHCB3；其他3種合稱為微量LHCⅡ，分別為LHCⅡa(LHCB4)、LHCⅡc(LHCB5)、LHCⅡd(LHCB6)[1]。

LHCB4別稱CP29，是PSⅡ內部天線葉綠素a/b結合亞復合體，其為次要捕光色素蛋白，較其他蛋白復合體更接近PSⅡ核心復合物，其編碼基因為Lhcb4[1]。目前已從擬南芥、秈稻、楊樹、菠菜、銀杏等多種高等植物中克隆了Lhcb4基因，并研究了其在各種生態環境下的表達情況[5-10]。

近年，茶樹育種目標傾向葉色多樣化，白化或紫化等特異葉色品種的選育成為茶樹新品種選育的熱點。研究表明，光是誘導茶樹花青素形成的主要原因[11]，光合作用與花青素的合成之間是否存在一定關系有待于研究。本研究從紫芽中篩選到下調表達基因片段，Blastx比對為Lhcb4的部分基因片段。以該基因片段為探針，在NCBI中Blast檢索茶樹中與探針序列相似性較高的ESTs，然后利用DNAstar進行序列拼接，得到茶樹葉綠素a/b結合蛋白CP29基因(CsLhcb4)，利用生物信息學技術預測該基因編碼蛋白的理化性質和結構分析，為后續研究CsLhcb4與花青素代謝的關系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

筆者所在研究組從紫芽中篩選的差異表達基因片段(D-ZY-5)，經Blastx比對為Lhcb4的部分基因片段。

1.2 方法

1.2.1 茶樹CsLhcb4基因的電子克隆 以差異篩選的EST基因片段為查詢探針，利用NCBI中的Blastn工具，搜索茶樹EST數據庫(taxid：4442)，得到具有高度同源性(選擇相似性大于等于90%，覆蓋率大于100 bp)的EST序列，再利用DNAStar進行重疊區域拼接和組裝，構建重疊序列群。以重疊序列群為信息標簽，進一步檢索比對，搜索高度同源序列，并拼接組裝，直至沒有發現高度同源序列。在非冗余數據庫中進行搜索，確認新基因序列，獲得茶樹CsLhcb4的cDNA序列。

1.2.2 茶樹CsLhcb4基因及蛋白質序列的生物信息學鑒定 以NCBI的ORFfinder和Conserved Domain Database功能對擴增的基因序列進行蛋白質翻譯及其保守結構域預測。以Expasy的在線分析軟件對蛋白序列進行理化性質(ProtParam tool)、疏水性(ProtScale)、二級結構(SOPMA)和三維結構分析預測(SWISS-MODEL)，同時利用在線分析工具分析無序區域(foldindex)、亞細胞定位(TargetP 1.1 Server)及磷酸化位點預測(NetPhos 3.1 Server)。利用NCBI的PSI-BLAST進行蛋白序列同源比對，利用DNAman軟件進行同源蛋白的氨基酸多序列比對并用Mega構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 茶樹CsLhcb4基因克隆及序列分析

以篩選的EST基因片段為查詢探針，利用Blastn對茶樹EST數據庫進行搜索，得到2個高度同源的EST序列(FS954792.1和JK993206.1)，利用DNAStar對序列進行重疊區域拼接和組裝，在以拼接的重疊序列群進行檢索，得到高度同源的EST序列(FS960161.1)，重復拼接得到茶樹CsLhcb4基因cDNA序列，長度為1 085 bp。經ORFfinder分析，該基因包含1個858 bp的ORF，編碼1個含285個氨基酸的蛋白質。

2.2 茶樹CP29蛋白保守結構域預測

利用NCBI在線分析軟件Conserved Domain Database(CDD)對蛋白進行結構域分析，結果(圖1)顯示，在茶樹葉綠素a/b連接蛋白CP29的氨基酸序列第13個和第285個之間存在光系統Ⅱ光捕獲復合體結構域(PLN00187)，編碼蛋白屬于葉綠素a/b連接蛋白超家族成員。

2.3 茶樹CP29蛋白同源比對及序列進化分析

在NCBI中的Blastp中采用PSI-Blast方法在refseq數據庫中進行氨基酸序列同源比對，結果顯示，有478個蛋白與茶樹CP29蛋白同源，一致性最大為89%，最小為32%，這些蛋白包括假定未知的蛋白、預測的蛋白、功能已鑒定的蛋白，它們都有葉綠素a/b結合蛋白超家族結構域(PLN00187)，相對保守。在功能已鑒定的蛋白中，茶樹CP29蛋白與陸地棉CP29.1(NP001314598.1)、歐洲大葉楊CP29(XP002323575.1)、大豆CP29(NP001304343.1)、擬南芥(NP187506.1)、深山南芥(XP002873005.1)、玉米(NP001105502.1)、衣藻(XP001697193.1)、綠藻(XP005646225.1)一致性分別是87%、87%、87%、83%、83%、82%、51%、47%，這表明植物葉綠素a/b連接蛋白CP29序列在不同植物之間具有一定程度的序列分化。利用DNAman軟件將茶樹與這8個植物的CP29蛋白進行多重比較分析，序列一致性為74.19%(圖2)。Mega構建系統發育樹表明，高等植物的CP29區別于藻類，在進化距離上較近；茶樹與大豆、歐洲大葉楊和陸地棉進化距離最近，聚為一類(圖3)。

2.4 茶樹CP29蛋白理化性質分析

CsLhcb4編碼的蛋白質分子式為C1 427H2 180N366O407S4，分子量為31.1 ku，理論等電位點5.79。亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)占比最大，分別為11.2%和10.9%，芳香族氨基酸[苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)]33個，占比11.6%。負電荷殘基[天冬氨酸(Asp)+谷氨酸(Glu)]數為31個，正電荷殘基[精氨酸(Arg)+賴氨酸(Lys)]數為27個，脂溶系數為84，總平均疏水性為-0.099。不穩定系數31.69，該蛋白為穩定蛋白。無序區域預測結果表明，其存在1個無序區域1～50位氨基酸處，不可折疊性0.194，對蛋白折疊、表達水平干擾較小。

2.5 茶樹CP29蛋白疏水性分析

用ProtScale軟件對蛋白質進行疏水性/親水性分析(圖4)，正值越大表示越疏水，負值越大表示越親水，介于+0.5～-0.5之間的主要為兩性氨基酸。結果表明，Glu191疏水性最強，疏水性參數為2.789；Leu206和Asp207親水性最強，疏水性參數為-2.333。蛋白中約在183～197區域疏水性最強，其次是245～256、144～157區域具有較強的疏水性；在199～219區域親水性最強，其次在38～54、227～232區域具有較強的親水性。該蛋白的親水區域大于疏水區域，預測該蛋白為親水蛋白，與ProtParam分析結果一致。

2.6 茶樹CP29蛋白亞細胞定位預測

結合TargetP亞細胞定位預測(表1)，蛋白定位于葉綠體。CP29為植物PSⅡ3種次要捕光色素蛋白之一，蛋白亞細胞定位結果符合其功能預測。

表1 茶樹CP29蛋白亞細胞定位

2.7 茶樹CP29蛋白磷酸化修飾位點及分析

磷酸化是蛋白翻譯前修飾的最常見的形式之一，在調節從基因表達到信號和代謝調控等所有細胞功能中都起作用[4]。CP29的磷酸化可能與植物的抗逆有關[12-13]，其磷酸化可能是調節光能的捕獲及激發能向反應中心傳遞的一種方式，也是一種新的光保護機制。利用NetPhos 3.1預測茶樹CP29蛋白磷酸化位點，結果(表2)顯示，CP29蛋白磷酸化位點有23個，其中Thr 9個，絲氨酸(Ser)10個，Tyr 4個。

2.8 茶樹CP29蛋白二級結構預測和分析

利用SOPMA在線預測蛋白的二級結構(圖5)，α-螺旋和無規則卷曲是其主要二級結構，其中115個氨基酸可能形成無規則卷曲，占40.35%，97個氨基酸可能形成α-螺旋，占34.04%，49個氨基酸可能形成延伸鏈，占17.19%，24個氨基酸可能形成β-轉角，占8.42%，不含其他二級結構。

2.9 茶樹CP29蛋白三級結構建模及分析

利用swiss-model在線對其進行建模，從PDB(蛋白質結構數據庫)中獲得63個同源蛋白序列，選擇其中的3jcu.1菠菜PSⅡ-LHCⅡ超分子復合物，與靶標序列比對結果作模板，其序列一致性為88.51%，獲得其三級結構(圖6)。三級結構從N端開始形成8端螺旋結構，至C端形成較長的延伸鏈。建模結果估值(OMQE)為0.75，介于0～1之間，接近1，建模結果處于接受水平。但是QMEAN4值為-3.95，其理想值為1，因此建模結果并不十分理想。

3 討論與結論

LHC蛋白是高等植物光合作用過程中的重要功能蛋白，本研究以在紫芽中下調表達的基因片段(D-ZY-5)為查詢探針，通過電子克隆的方式得到編碼茶樹CP29蛋白基因的cDNA序列，命名為CsLhcb4，長度為1 085 bp，ORF為 858 bp，編碼285個氨基酸，分子量為31.1 ku。蛋白保守結構域分析表明其編碼氨基酸序列第13個和第285個之間存在光系統Ⅱ光捕獲復合體結構域(編號PLN00187)，屬于葉綠素a/b連接蛋白超家族成員。亞細胞定位于葉綠體上，與蛋白預測的功能相吻合。

表2 茶樹CP29蛋白磷酸化修飾位點預測

氨基酸同源序列分析表明，克隆的茶樹CsLhcb4編碼氨基酸與這些序列相似性為32%～89%，總體上相對保守，屬于葉綠素a/b結合蛋白CP29。構建進化樹表明，茶樹與高等植物陸地棉、綠豆和煙草進化距離最近，聚為一類。

二級結構分析表明，α-螺旋和無規則卷曲是茶樹CP29的主要二級結構，α-螺旋是一種穩定結構，能維持蛋白的結構穩定性。三維結構分析表明，基于茶樹CP29與菠菜PSⅡ-LHCⅡ超分子復合物(3jcu.1)序列同源性為88.51%，利用Swiss-Model中的同源建模法構建茶樹CP29的三維結構，構建模型為單體形式。

氨基酸序列親水性/疏水性分析結果顯示，該蛋白的親水區域大于疏水區域，預測該蛋白為親水蛋白。不穩定系數為31.69，該蛋白為穩定蛋白，能穩定保持其與葉綠素a/b形成的復合體，傳輸光能，促進光合作用。

在高等植物中，CP29在LHCⅡ中分子量最大，結構最簡單，光譜值相對簡單，結合6個葉綠素a、2個葉綠素b和2個類胡蘿卜素分子，其結構及功能研究相對明確[14-15]。研究表明，CP29是植物光系統Ⅱ天線蛋白不可或缺的結構組成，在非光化學淬滅(NPQ)作用中至關重要，其缺失會造成光系統Ⅱ結構變化，并影響光保護作用[16-18]。CP29的磷酸化可能與植物的抗逆性有一定關系，低溫、強光等逆境能誘導CP29的磷酸化，其磷酸化可在多個位點發生，并通過可逆磷酸化調節和決定LHCⅡ在2個光系統之間的親和性和LHCⅡ的狀態遷移[19]。

本研究通過電子克隆方式得到在高花青素茶樹中下調表達的葉綠素a/b結合蛋白CP29基因，通過生物信息學分析預測其理化性質、二級結構和三維結構，為進一步研究CP29在高花青素茶樹代謝中的作用奠定了基礎。CP29是否通過光保護作用或磷酸化等來影響花青素的代謝有待于進一步研究。

捕光色素蛋白有14類，最初序列上的相似性卻表明這些色素蛋白都起始于1個相同的原始基因，原始基因能夠編碼1個含跨膜螺旋的蛋白[4]。高等植物的PSⅡ外周光捕獲蛋白都在非光化學淬滅(NPQ)下發揮其作用，起到光保護作用[17]。因此，在CP29的研究基礎上繼續對高花青素茶樹捕光色素蛋白的表達及功能進行研究具有一定的意義。

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[1]孫欽秒，冷 靜，李良璧，等. 高等植物光系統Ⅱ捕光色素蛋白復合體結構與功能研究的新進展[J]. 植物學通報，2000，17(4)：289.

[2]Labate M T，Ko K，Ko Z W，et al. Constitutive expression of peaLhcb1-2 in tobacco affects plant development，morphology and photosynthetic capacity[J]. Plant Molecular Biology，2004，55(5)：701-714.

[3]李曉鵬. 杜林方和梁厚果.菠菜光系統Ⅱ天線組分CP29的分離及其性質[J]. 生物化學與生物物理學報，1999，31(6)：631-636.

[4]羅 玲. 捕光色素蛋白復合物的研究進展[J]. 現代農業科技，2008(22)：270-273，276.

[5]Xu Y H，Liu R，Yan L，et al. Light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins are required for stomatal response to abscisic acid inArabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63(3)：1095-1106.

[6]袁定陽，余 東，譚炎寧，等. RT-PCR克隆秈稻葉綠素a/b結合蛋白基因全長cDNA及序列的in silico分析[J]. 基因組學與應用生物學，2012，31(2)：173-177.

[7]王歡利，劉新亮，郁萬文，等. 銀杏葉綠素a/b結合蛋白基因(GbLhcb4)及其啟動子克隆[J]. 中南林業科技大學學報，2015，35(5)：114-121.

[8]Klimmek F，Sj?din A，Noutsos C，et al. Abundantly and rarely expressed Lhc protein genes exhibit distinct regulation patterns in plants[J]. Plant Physiology，2006，140(3)：793-804.

[9]Pan X，Li M，Wan T，et al. Structural insights into energy regulation of light-harvesting complex CP29 from spinach[J]. Nature Structural & Molecular Biology，2011，18(3)：309-315.

[10]鄒 智，安 鋒，楊禮富，等. 大戟科Lhcb基因家族的全基因組鑒定、分類與進化分析[J]. 中南林業科技大學學報，2013，33(12)：46-52.

[11]張澤岑，王能彬. 光質對茶樹花青素含量的影響[J]. 四川農業大學學報，2002，20(4)：337-339.

[12]劉文娟，袁 澎，林宏輝. 高等植物的光系統Ⅱ蛋白磷酸化機制及其對環境脅迫的響應[J]. 植物生理學通訊，2007，43(6)：995-1001.

[13]Liu W J，Chen Y E，Tian W J，et al. Dephosphorylation of photosystem Ⅱ proteins and phosphorylation of CP29 in barley photosynthetic membranes as a response to water stress[J]. Biochimica et Biophysica acta，2009，1787(10)：1238-1245.

[14]Pascal A，Peterman E，Gradinaru C，et al. Structure and interactions of the chlorophyll a molecules in the higher plantLhcb4 antenna protein[J]. Journal of Physical Chemistry B，2000，104(39)：9317-9321.

[15]Gastaldelli M，Canino G，Croce R，et al. Xanthophyll binding sites of the CP29 (Lhcb4) subunit of higher plant photosystem Ⅱ investigated by domain swapping and mutation analysis[J]. Journal of Biological Chemistry，2003，278(21)：19190-19198.

[16]de Bianchi S，Betterle N，Kouril R，et al.Arabidopsismutants deleted in the light-harvesting proteinLhcb4 have a disrupted photosystem Ⅱ macrostructure and are defective in photoprotection[J]. The Plant Cell，2011，23(7)：2659-2679.

[17]Mozzo M，Passarini F，Bassi R，et al. Photoprotection in higher plants：the putative quenching site is conserved in all outer light-harvesting complexes of photosystem Ⅱ[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2008，1777(10)：1263-1267.

[18]Miloslavina Y，de Bianchi S，Dall’osto L，et al. Quenching inArabidopsisthalianamutants lacking monomeric antenna proteins of photosystem Ⅱ[J]. The Journal of Biological Chemistry，2011，286(42)：36830-36840.

[19]Kargul J，Turkina M V，Nield J，et al. Light-harvesting complex Ⅱ protein CP29 binds to photosystem Ⅰ ofChlamydomonasreinhardtiiunder state 2 conditions[J]. FEBS Journal，2005，272(18)：4797-4806.