芝麻立枯病生防菌G10菌株生防特性分析

張 穎， 王俊芳

(河南大學生命科學學院，河南開封 475004)

由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的芝麻立枯病是一種嚴重的土傳病害，廣泛分布于各芝麻種植區[1]。目前，由于缺乏抗病芝麻品種，生產上主要通過施用化學殺菌劑控制該病害，導致藥劑殘留、病原菌產生抗藥性、環境污染、芝麻種植成本提高與品質下降等狀況發生[2]，采用環保的生物防治技術替代傳統的化學方法防治芝麻病害是目前芝麻種植中亟待解決的問題。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一類廣泛分布于自然環境中的革蘭氏陽性細菌，大多數對植株、人、畜無害，且不污染環境，這類細菌因其能產生多種抑菌物質，且能形成耐熱、耐酸堿和抗逆性強的芽孢，從而作為植物病害生防菌得到廣泛的研究和應用[3-5]。在筆者前期研究工作中，從健康芝麻苗根部分離到1株對芝麻立枯病有顯著防治效果的內生細菌，該菌株編號為G10，經鑒定為枯草芽孢桿菌[6]。為明確G10菌株在植物病害生物防治中的應用潛力，本研究分別測定pH值、溫度、鹽離子、紫外線等對其代謝產物抑菌效果的影響，以期為該菌生防制劑的研發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料及培養基

枯草芽孢桿菌G10菌株、立枯絲核菌菌株均由河南大學微生物實驗室提供；G10菌株培養采用KBM培養基(2.00%蛋白胨、1.00%甘油、0.15% K2HPO4、0.15% MgSO4·7H2O、2.00%瓊脂，121 ℃滅菌20 min)[7]；立枯絲核菌培養采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 000 mL自來水)[8]；生物膜測定使用LB培養基(1.0%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1.0% NaCl、2.0%瓊脂)和Landy培養基(2.00%葡萄糖、0.50%谷氨酸、0.50 g MgSO4、0.50 g KCl、1.00 g KH2PO4、0.15 mg Fe2SO4·6H2O、5.00 mg MnSO4·H2O、10.16 mg CuSO4·5 H2O，1 000 mL蒸餾水)。

1.2 試驗方法

1.2.1 G10菌株代謝產物對立枯絲核菌生長半抑制有效濃度(EC50)的估算 將活化后的G10菌株培養物轉接于KBM液體培養基中，每瓶培養基裝液量為30 mL，于30 ℃、200 r/min 振蕩培養48 h；將培養液離心，收集上清液，過濾，將無菌發酵液與溫度不低于45 ℃的固體PDA培養基混合，分別配制成發酵液濃度為2%、5%、10%、20%、30%、40%等的培養基。將配制好的培養基倒平板，將活化后的立枯絲核菌打成6 mm菌餅，轉接于平板中央；以不添加發酵液的PDA培養基為對照，30 ℃培養24 h，統計G10菌株代謝產物對立枯絲核菌的抑制率，公式如下：

抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

1.2.2 G10菌株代謝產物濃縮液的制備及不同pH值對其抑制立枯絲核菌的影響 G10菌株無菌發酵液制備方法同“1.2.1”節，利用旋轉蒸發儀將無菌上清液濃縮50%，將培養48 h后的生防菌代謝產物濃縮液分裝入不同的管中，分別用乳酸和NaOH溶液調節濃縮液的pH值，使其pH值分別為1、2、3、4、5、10、11、12、13，4 ℃保存備用。

將活化的立枯絲核菌平板培養物打成菌餅，將菌餅置于PDA平板中央，在距離平板中央2 cm處對稱放置4個牛津杯，分別取150 μL以上不同pH值的濃縮液，注入杯中；設只接立枯絲核菌的平板為空白對照1，相應pH值的無菌KBM液體培養基為空白對照2。30 ℃培養24 h，統計G10菌株代謝產物對立枯絲核菌的抑制率。對照2的抑菌率=[(對照1菌落直徑-對照2菌落直徑)/對照1菌落直徑]×100%；生防菌發酵液抑菌率=[(對照2菌落直徑-處理菌落直徑)/對照2菌落直徑]×100%。

1.2.3 不同溫度處理后G10菌株代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用 將“1.2.2”節中代謝產物濃縮液分裝入不同的管中，將各管分別放入溫度為-20、40、50、60、70、80、90、100 ℃的水浴鍋中處理20 min；測定處理后的代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用，方法同“1.2.2”節。以濃縮液不處理的板為對照，計算抑菌率，方法同“1.2.1”節。

1.2.4 不同鹽離子條件下G10菌株代謝產物的抑菌作用 分別配制1 mol/L的CaCl2、NaCl、KCl、MgSO4、AlCl3、CuSO4溶液，將“1.2.2”節中代謝產物濃縮液分裝入不同的管中，分別加入適量上述各鹽溶液，使各管中的鹽離子濃度為 20 mmol/L。測定處理后代謝產物的抑菌作用，方法同“1.2.2”節。以濃縮液不處理的板為對照，計算抑菌率，方法同“1.2.1”節。

1.2.5 不同紫外線劑量條件下G10菌株代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用 將“1.2.2”節中濃縮液以5 mL/皿裝入無菌培養皿內，3次重復，在20 W紫外燈下分別照射5、10、15、20、25、30 min，測定濃縮液的抑菌作用，方法同“1.2.2”節。以濃縮液不處理的板為對照，計算抑菌率，方法同“1.2.2”節。

1.2.6 G10菌株生物膜形成能力的測定

1.2.6.1 定性測定生物膜形成 將活化后的生防菌轉接于裝有30 mL KBM液體培養基的250 mL三角瓶中，在30 ℃、200 r/min搖床上振蕩培養，培養至對數期。將對數期的生防菌菌懸液以10%的接種量分別轉接于含有2 mL LB培養基和Landy培養基的5 mL玻璃試管中(直徑為0.8 cm)，23 ℃靜置培養6 d，觀察菌體在試管內的生長情況，定性測定生物膜的形成情況[9]。

1.2.6.2 結晶紫顯色法測定生物膜的形成 取“1.2.6.1”節中長有生物膜的試管，小心吸出2 mL管中培養液，注意保持管壁生物膜的完好。滴加3 mL濃度為0.1%的結晶紫溶液，常溫染色20 min。然后去除染液，加蒸餾水脫色3次。向管中加入2.5 mL乙醇、丙酮混合溶解液(乙醇、丙酮的體積比為8 ∶2)，待生物膜溶解后，以溶解液作為對照，利用分光光度計測定570 nm處的吸光度(D570 nm)。重復10次。

1.3 數據分析

對試驗數據進行方差分析、顯著性檢驗和新復極差法多重比較。

2 結果與分析

2.1 生防菌代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用

利用平板培養法檢測不同濃度條件下G10菌株代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用。由表1可知，隨著代謝產物濃度的升高，抑菌率逐漸提高，不同濃度代謝產物的抑菌率差異顯著(P<0.05)。

表1 不同濃度G10菌株代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用

注：數據后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

利用表1中數據進行線性回歸分析，估算代謝產物的半抑制有效濃度，以抑制率作為橫坐標X，并對抑菌率進行概率坐標轉換，查表得轉換數據(X′)，以代謝產物濃度作為縱坐標Y，并對代謝產物濃度進行對數轉換(Y′)。由圖1可知，通過線性回歸分析得回歸方程Y′=0.646 0X′+1.103 3，r2=0.990 8。EC50處的抑制率為50%，相應的X′=0，Y′=12.68，在這種處理條件下，G10代謝產物對立枯絲核菌的半抑制有效濃度為12.68%。

2.2 不同pH值條件下G10菌株代謝產物的抑菌作用

利用平板對峙培養法檢測不同pH值條件下濃縮50%的G10菌株代謝產物及相應pH值條件下KBM培養基對立枯絲核菌的抑制作用。由圖2可知，該菌代謝產物在pH值為 6～9 范圍內穩定，發揮正常的抑菌作用；在pH值≤5及pH值≥10的條件下，其代謝產物的抑菌率逐漸下降。pH值為 6～9 時與pH值為10～13、1～4時的抑菌率，pH值為10～11、3～5時與pH值為12～13、1～2時的抑菌率差異達顯著水平(P<0.05)。pH值為12時與pH值為13時的抑菌率差異顯著(P<0.05)。

由圖3可知，在pH值為4～10范圍內立枯絲核菌可以正常生長；在pH值≤3及pH值≥11時，KBM培養基抑制立枯絲核菌的生長。

2.3 溫度對G10菌株代謝產物抑菌作用的影響

經不同溫度處理G10菌株代謝產物濃縮物，用對峙培養法測定其代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用。由圖4可知，經40、50 ℃處理，G10菌株代謝產物的抑菌率與對照無顯著差異，其他溫度處理的G10菌株代謝產物的抑菌率與對照均差異顯著(P<0.05)； 80 ℃與90、100 ℃ 處理的G10菌株代謝產物的抑菌率差異顯著。

2.4 不同鹽離子對G10菌株代謝產物抑菌作用的影響

采用對峙培養法檢測生防菌代謝產物在不同鹽離子條件下對立枯絲核菌的抑制能力。由圖5可知，對照與添加鹽離子處理的發酵液的抑菌率差異極顯著(P<0.01)；添加NaCl、KCl、CaCl2、AlCl3與添加MgSO4、CuSO4的發酵液的抑菌率差異顯著(P<0.05)；添加NaCl、KCl、CaCl2、AlCl3的發酵液之間的抑菌率差異不顯著，添加MgSO4、CuSO4的發酵液的抑菌率差異不顯著。

2.5 紫外線對G10菌株代謝產物抑菌作用的影響

生防菌代謝產物經不同時間的紫外線照射后，用牛津杯法測定G10菌株代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用。由圖6可知，對照與紫外線處理5、10 min與其他處理的發酵液抑菌率差異極顯著(P<0.01)；紫外線處理15、20、25 min與處理30 min的抑菌率差異極顯著(P<0.01)。對照與紫外線處理5、10 min之間的抑菌率差異不顯著； 紫外線處理15、20 min與處理25 min的抑菌率差異不顯著。

2.6 G10菌株生物膜形成能力測定

測定內生菌形成生物膜的能力，將G10菌株分別接入LB和Landy液體培養基中進行培養。由圖7可知，2管均形成生物膜，左管為LB培養基培養，右管為Landy培養基培養，其中Landy培養基內的生物膜相對較厚。利用結晶紫顯色法測定G10菌株形成生物膜的能力，結果顯示利用LB培養基培養時，該菌株形成的生物膜D570 nm平均值為1.125，利用Landy培養基培養時，D570 nm平均值為1.632。說明菌體在普通培養基內培養即可形成明顯的生物膜，但不同營養條件下菌體產生生物膜的能力不同。

3 討論與結論

利用平板培養法檢測不同濃度條件下G10菌株代謝產物對立枯絲核菌的抑制作用，結果顯示，隨著G10菌株發酵液濃度的提高，抑菌率逐漸提高，不同濃度發酵液抑菌率差異顯著(P<0.05)；對試驗數據進行線性回歸分析，估算出G10代謝產物對立枯絲核菌的EC50為12.68%；G10菌株代謝產物在pH值為6～9范圍內穩定，發揮正常的抑菌作用；在pH值 ≤5及pH值≥10時， 其代謝產物的抑菌率逐漸下降。該

菌代謝產物在40～50 ℃溫度范圍內抑菌率差異不顯著，高于60 ℃時代謝產物抑菌率顯著下降(P<0.05)；研究顯示幾種鹽離子對代謝產物的抑菌率均有一定的負作用；紫外線照射處理10 min內該菌代謝產物抑菌性能穩定，紫外線照射處理時間大于15 min時抑菌率逐漸下降。利用LB培養基培養時，菌株G10形成的生物膜D570 nm平均值為1.125，利用Landy培養基培養時，D570 nm平均值為1.632。有研究顯示，生防菌生物膜的形成能力與其防效呈正相關[9-10]。內生細菌G10菌株為芽孢桿菌，利用其產芽孢的優勢，相對耐受不良環境的能力強，結合以往關于該菌對芝麻立枯病生防的研究，該菌在芝麻苗根部定殖能力強，溫室試驗防效為80%，田間小區試驗防效為61%；該菌株有作為生防制劑的開發潛力。

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